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上一篇文章中，我們探討了關於HPLC色譜柱的十大「神話」其中五項（點擊此處跳轉查閱。），今天我們將繼續探討：
神話六：小粒徑填料色譜柱的柱效總是相對更高
神話七：對於矽膠填料，殘留的矽醇基是造成拖尾的原因
神話八：矽膠基質填料只能夠在pH2到7使用
神話九：當代HPLC柱至少應該能承受1000次進樣
神話十：色譜柱總是應該密封緊密，以防填料因與空氣接觸而損壞
HPLC色譜柱十大「神話」（下）
神話六：小粒徑填料色譜柱的柱效總是相對更高
錯誤！
對於一個裝填良好的色譜柱而言，隨著所裝填的填料平均粒徑的減小，柱效提高；但是對於某個特定的HPLC儀器，如果引起峰展寬的柱外效應足夠大，小粒徑填料色譜柱的高柱效就不能做到。
柱外峰展寬效應是由填料本身以外的所有額外的體積引起，它們包括：
1. 進樣體積，包括進樣環以及進樣閥內的額外體積
2. 從進樣閥（器）出口到色譜柱入口的管路體積
3. 保護柱內的間隙體積（保護柱如果有柱頭，還包括柱頭內體積）
4. 在線過濾器內體積
5. 色譜柱入口到色譜填料之間的一段距離的體積，包括篩板孔隙和液流路徑的體積
6. 色譜柱內填料顆粒之間的間隙體積
7. 色譜柱色譜填料到出口的一段距離的體積，包括篩板孔隙和液流路徑的體積
8. 色譜柱出口到檢測器入口的管路體積
9. 檢測器入口到流通池的管路體積
10. 檢測流通池體積
上述均為柱外體積。
因此，即便能夠做到把進樣量最小化，保持色譜柱入口前的管路盡可能短，內徑盡可能小。但如果從色譜柱出口到檢測器用了內徑0.02英寸的管路有1米長，譜帶展寬效應就可能會大到影響色譜分離的總體效果。所以，想要在小於2μm粒徑填料的色譜柱或者1.0mm內徑的微經柱上得到期望的分離效率，就要確保把HPLC體系的柱外效應減到最小。
神話七：對於矽膠基質填料，殘留的矽醇基是造成拖尾的原因
錯誤！
在特定條件下，矽膠基質鍵合柱上存在的矽醇基，尤其是在分析鹼性物質時，能夠造成峰拖尾。
拖尾的原因在於矽醇基團本身就是一個弱酸，pKa大約在4.5和4.7之間。因此當流動相pH值在4到5的時候，矽醇就會離子化，並與諸如質子化的胺類等帶正電荷的分子通過靜電引力發生作用。可以通過將pH降到3以下來抑制矽醇基的離子化的方式盡量減小該種作用。但是對於許多鹼性化合物，在低pH條件下也能夠發生拖尾。只有經過特別設計的專門的反相色譜填料，對鹼性化合物的測定，能獲得好的峰形。
三種原因能夠造成拖尾：化學問題（上文已經部分討論過）、柱填充問題和色譜設備硬件問題。
三種問題都可以造成拖尾，但是要解決問題，就需要找到問題的根源。詳細探究這三種原因超出了本文的範圍，這里就三種類型的問題分別舉幾個實例，使大家有一個大概的認識。
首先，除了矽醇基的作用外，化學因素的拖尾還有其它幾種方式：
能與金屬產生螯合作用的化合物與色譜填料中的痕量金屬作用引起的拖尾，在早期的矽膠基質填料中特別明顯；
錯誤的進樣溶劑選擇能夠導致拖尾，使用比流動相強的溶劑進樣也能夠導致峰變形失真；
樣品中不容易洗脫的強保留組分和流動相中的雜質在柱頭的逐步累積也可導致拖尾，這些在柱頭累積的物質能扮演不同的固定相角色，與經過的分析物作用而導致分析物峰形拖尾；
存在混合模式的保留作用也能夠誘發拖尾，如分析物與活性基團既有反相作用也有離子相互作用的情況；
流動相pH選擇錯誤，樣品部分離子化，分子態和離子態共存，混合模式作用就能夠導致峰變形和拖尾；
一個大的色譜峰後面如恰好有一個洗脫出峰時間相差不大的的小峰，看上去也和拖尾一樣；
柱頭的填料空隙可以導致峰分叉或者拖尾，柱床上有微小的溝槽能使峰形過寬；
進樣濃度過大，樣品過載也會導致拖尾，當然樣品過載導致峰前延的情況就更常見了；
如果樣品進得少了，因為過多的矽醇基存在，也能夠導致拖尾；
……
接下來來討論下儀器硬件問題導致拖尾的情況：
前面說的管路死體積（extracolume）和接頭體積能夠導致拖尾；
進樣時的瞬間加壓可以造成柱頭填料塌陷（有空洞形成）從而引起拖尾；
反應比較慢的檢測器用來檢測快速洗脫出的分析物時會形成峰展寬和拖尾（和流通池厚度，長度有關）；
前文中說的柱操作溫度和流動相溫度不一致也會引起拖尾；
……
所以說，造成HPLC色譜峰拖尾的不總是矽醇基。
神話八：矽膠填料只能夠在pH2到7使用
錯誤！
通常有兩種HPLC反相柱的化學損壞機理：在低於pH2時,矽氧鍵的催化水解；在pH大於7或8時，矽膠被水中OH離子溶解。
Kirkland和其合作者對這兩種機理做過詳細的研究：
pH小於2的時候，-Si-O-Si-可以被水合氫離子H3O+進攻，固定相就會流失斷裂。隨著時間的推移，隨著載碳量下降保留值會慢慢下降。有三甲基氯矽烷等短鏈封端的色譜柱，由於封端試劑更易水解流失，這種現象更為明顯。長鏈C18固定相因為空間位阻效應，對於這樣一種流失有一定的保護作用，但是最終仍然會慢慢被侵蝕，尤其是溫度高於環境溫度時。空間保護和高密度鍵合有助於防止矽膠鍵合相的流失。聚合基質固定相在這種條件下表現良好，但是比起矽膠固定相，其柱效要低。
在高pH方面，一定需要有保護矽膠基體免於氫氧根離子進攻的措施。一旦溶解過程開始，隨著柱床內空洞出現，色譜柱會最終失效。
所以市面上開發了雙矽烷交聯C18（bidentate C18）、有機無機雜化顆粒以及聚合物包覆矽膠等耐高pH的特種色譜柱，這些柱子都使用了化學方法來保護固定相避免OH–的攻擊，能夠承受pH11-12的條件。但在如此鹼性pH條件下，柱子要避免在高溫條件下使用。
當然，聚合物基質色譜柱能夠在pH13甚至14的條件下使用，但是，前文已經指出，聚合物柱比矽膠柱柱效要差些。
因此，總的說來，特殊的矽膠柱能夠在pH2-7以外的範圍使用，但是普通矽膠色譜柱要格外小心，由其是在高溫條件下。
神話九：當代HPLC柱至少應該能承受1000次進樣
錯誤！
現代HPLC色譜柱能夠承受的進樣數量由許多因素決定：
有些因素基於色譜作用的模式不同而不同：反相色譜，離子交換色譜，排阻色譜，正相色譜，手性色譜，親水交互色譜等等；
有些因素基於不同的填料基體：矽膠基質，雜化基質，氧化鋯基質，聚合物基質，或者是凝膠和有一定交聯度的聚合物樹脂；
有些因素基於固定相本身的一些特性：表面鍵合度，鍵合方式，聚合還是單層鍵合，或者是聚合物包覆；
其他的因素和色譜應用條件有關：pH，溫度，流動相組成，緩沖液組成，流速，壓力等等；
還有些和樣品有關：完全標樣，樣品潔淨度，樣品pH，樣品體積（含量），樣品雜質，分析物分子本身特性等。
如果一根柱子被濫用，比如在pH範圍外，或者流速範圍外，很有可能連50次進樣都成問題。
如果樣品里都沒有強保留物質，5000次使用也不為過。
如果色譜柱不在其承受力上限上連續使用，壽命會更長。
如果柱子進樣的樣品繁雜，但是從來不沖洗除去柱子里的強保留物質，壽命必然減少。
通過對許多制藥公司訪問得到的經驗表明，絕大多數5μm反相色譜柱在分析制劑、簡單藥品混合物和標樣的情況下能夠承受至少1000次進樣。如果樣品「很髒」，比如沒有進行過嚴格完全淨化的生物樣品提取物或環境樣品提取物，1000次進樣是有問題的。
所以說柱子能夠承受的進樣次數不是絕對的，而是取決於柱子的類型，操作條件，樣品潔淨程度和柱子被濫用程度等。當然，使用保護柱或在線過濾器，柱子的壽命會延長。
在很多個專業研討會上，通過對聽眾非正式的投票調查，結果表明：只有不到15%的使用者實際記錄了某支特定色譜柱能夠用的次數，很多色譜工作者並不真正知道每支色譜柱到底能夠使用多少次進樣。一些現代的HPLC儀器的軟件可以記錄或監控進樣的次數。
神話十：色譜柱總是應該密封緊密，以防填料因與空氣接觸而損壞
錯誤！
通常色譜柱兩頭的微孔的直徑不到0.02英寸，所以在如此小的截面積的區域內，空氣進入和填料接觸以及色譜柱內溶劑蒸發所造成的損傷都十分微小。即使是有部分空氣進入色譜柱，也很難擴散通過致密的填料床，接觸足夠多的填料而造成損害。
假若柱子中有了部分空氣，只要裝在色譜儀上運行一次，在高壓下殘留空氣會立即在流動相中溶解，然後流出色譜柱，不會對後面的使用有任何危害。
當然，如果你為了保險，死死的用柱塞頭擰緊也行。大部分柱子都配備了帶螺紋的柱塞頭，手動就能夠擰緊，以防止溶劑蒸發，空氣進入填料。
下篇預告：
《我的色譜柱怎麼了？》
經常做色譜分析的人大都碰到過這樣的問題：有時新購色譜柱剛開始進樣的幾針或幾十針不好用，到後來卻越用越順；有時新購色譜柱很好用，但用不了數十針就不靈了。 兩個看似矛盾的問題，確實會讓一些新手分析起來有些困難，下篇內容中，我們將從色譜填料的表面特性，其與分析物、雜質和流動相之間相互作用的化學、物理機理做深入的探討，相信會讓您對此類問題有新的認識和理解。
原文出處：
Ronald E. Majors,”Top HPLC Column Myths”，LCGC North America ,Volume 24, Issue 11 (Nov 01, 2006) , pg 1172–1182
Ron Majors, editor of “Column Watch” and “Sample Prep Perspectives,” has been withLCGC North Americafor over 26 years. Currently a senior scientist with Agilent Technologies, Wilmington, Delaware, Ron is known industry-wide as one of the premier chromatography experts in the field. He is also a member ofLCGC’s editorial advisory board.
編譯：姚立新納譜分析技術（蘇州）有限公司總經理
曾任國內知名色譜耗材公司的聯合創始人及副總經理，成功開發過多系列的色譜耗材產品並做到其規模化生產和銷售。擁有7項已授權的中國國家發明專利，發表論文20餘篇。熟知國內色譜耗材市場行情和發展趨勢，在該領域有十多年的市場行銷管理經驗。
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