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HPLC色譜柱十大「神話」（上）
我們認知中的HPLC色譜柱常識里面，是否全部正確，還是另有說法？
我們將分上、下兩篇，和大家探討關於HPLC色譜柱的十大「神話」。
上篇包含：
神話一：HPLC色譜柱不能反向使用
神話二：所有的C18（L1）柱都是一樣的
神話三：保護柱不會影響分離效果
神話四：提高溫度一定有利於分離效果
神話五：載碳量越高，反相色譜柱性能就越好
下篇預告：
神話六：小粒徑填料色譜柱的柱效總是相對更高
神話七：對於矽膠填料，殘留的矽醇基是造成拖尾的原因
神話八：矽膠基質填料只能夠在pH2到7使用
神話九：當代HPLC柱至少應該能承受1000次進樣
神話十：色譜柱總是應該密封緊密，以防填料因與空氣接觸而損壞
神話還是謠言？讓我們一探究竟。
神話一: HPLC色譜柱不能反向使用
錯誤！
實際上HPLC色譜柱的填裝壓力比最大使用壓力高很多（通常會高2倍）。如果裝柱時使用了恰當的勻漿劑，並且填裝完畢後維持裝柱壓力一定的時間使柱床穩定，一支填裝良好的色譜柱是完全可以雙向使用的。
哪些情況下需要反向使用色譜柱？
需要反向使用色譜柱的情況包括：柱轉換時的反沖、柱頭被強保留物質吸附污染時的色譜柱清洗（反沖的沖洗路徑更短更合理）、沖洗殘留在篩板上的顆粒物以降低柱壓或防止柱壓升高等。
另外，反向使用色譜柱還有一個例外，就是生產商在色譜柱的進樣端使用了孔徑更大的篩板時，反向使用可能會將填料從柱床沖出。
色譜柱在工廠填裝時，出口端的篩板孔徑必須比色譜柱中最小填料顆粒的粒徑還要小。譬如，色譜填料平均粒徑是5μm，粒徑分布範圍是3–7 μm, 出口端篩板孔徑必須小於3μm ，使填料沒有可能從柱床跑到色譜柱篩板外面。大多數生產廠家選擇的篩板孔徑是2μm。
那麼為什麼有些色譜柱生產廠家會選擇入口端和出口端採用不同孔徑的篩板呢？
原因很簡單——孔徑大的篩板相對孔徑小的篩板不容易堵，一個 0.5μm的篩板會比一個 2μm的篩板被堵得快。所以為了避免柱壓上升過快和客戶的抱怨，生產商會折中地選擇在入口端用一個孔徑稍大的篩板，且在色譜柱上標一個箭頭表示只能在一個方向使用。
因此當您考慮反向使用HPLC色譜柱時，最好仔細看一下說明書或者咨詢一下生產廠家是否能夠反向使用。
神話二：所有的C18（L1）柱都是一樣的
錯誤！
在HPLC發展初期，十八烷基矽烷（常被稱為ODS或C18）是最早的鍵合固定相之一，也導致了「反相色譜」這個新技術的誕生。C18 成為了反相色譜的標準固定相並被大部分色譜工作者所採用。
制藥工業是HPLC技術的最早使用者，監管部門不想偏袒任何一家色譜柱生產廠商的品牌，FDA和USP編寫了一套分類體系，給每一種藥物應用方面的新方法一個通用名稱。對HPLC色譜柱，命名為「L」，C18因為出現在大部分送審材料中，理所當然就成為了「L1」。隨著另外固定相的增加，分別都有了自己的「L」序列號（如：L7是C8，L10是CN基，L11是苯基等等）。
很不幸，這個命名體系被證明是不可靠的。因為每種商品化的C18色譜柱，雖然同樣是選用矽膠作為基體，但各自都有自己特定的填料鍵合合成工藝，因此色譜性能也不相同。
譬如——
有的生產廠商採用十八烷基一氯矽烷鍵合試劑和低表面積的矽膠（見上圖所示），而其它一些廠家採用同一矽烷試劑但選用了表面積更高的矽膠基體。這兩種C18柱表現的色譜性能不同，後者C18固定相的鍵合比例大於前者。(較低的固定相鍵合比率，表面未反應的矽醇基較多，有時混合保留機理起主要作用,色譜性能由此產生差異。)
某些色譜柱生產商使用二氯矽烷和三氯矽烷作鍵合試劑，將鍵合相聚合反應形成一很厚的具有不同擴散特性的疏水層。為使鍵合後矽膠表面未反應的矽醇基比例降低，有些生產商用小分子的矽烷試劑（如三甲基氯矽烷）封尾。矽醇基是在中性條件下測定鹼性物質時導致色譜峰拖尾的原因之一，有些生產廠家，更進一步的做法是採用第二種小分子矽烷進行雙封尾工藝，以提供一個更加惰性（疏水性）的矽膠表面。
另外有些生產商採用聚合物基體材料進行C18 鍵合，生產出一種完全不同的C18填料，但仍然被歸類到「L1」。
還有廠家採用反應性能不同的矽烷化試劑organoalkoxysilanes，製造出一種與氯矽烷反應產生的不同的C18 固定相。
……
而這些各有特色的C18色譜柱，統統被歸類為L1色譜柱。
神話三：保護柱不會影響分離效果
錯誤！
首先，保護柱用來保護分析柱避免強保留組分、顆粒物和其它一些不需要東西的污染，成本上又比分析柱便宜許多，能夠更頻繁地更換，的確是一個好主意。但如果保護柱的式樣或固定相選擇錯誤，保護柱也能夠對分離效果有很大影響。
理想的情況是：保護柱的固定相和分析柱恰好相同。
如果保護柱中固定相保留強（如高載碳量和混合相），會導致保留時間漂移，甚至導致不同的選擇性。如果保留弱，問題就不那麼明顯，除非固定相影響整個體系的選擇性。
另外為了使保護柱最小化的影響分離，保護柱需要合適的裝配。
顯然，保護柱安插在進樣口和分析柱之間，但是如果管路太長（太長或者內徑太大），就會造成額外的峰展寬，從而影響分離。一體化保護柱（保護柱直接接在色譜柱上），從以往的報導看，基本上會達到分析柱的最佳水平。但是，一體化保護柱通常和卡式色譜柱一起使用，目前已不是那麼流行。不管採用什麼形式的保護柱，都應當在不影響操作的前提下容易從HPLC系統中卸下和更換。
所以，雖然理論上，接上保護柱延長了分析柱的柱長，會增加柱效和色譜分離效果。但由於上面討論中的一些因素的影響，增加保護柱只能維持原來的色譜分離性能在最佳水平，有時候甚至會變差。因此大多數情況下，使用保護柱的好處是延長柱壽命，而非提高整體色譜分離效果。
神話四：提高溫度一定有利於分離效果
錯誤!
理論上，隨著溫度升高，流動相黏度下降，因此分析物傳質速率提高，所以就能夠提供更好的色譜分離效果。但是除了柱效，溫度同樣影響保留因子（k）和選擇性（α）。
溫度的變化能夠提高或降低分辨率（其實這也是色譜分析最關心的問題）。保留時間往往隨著溫度升高而降低，因為溫度作為一個熱力學參數，使得高溫度下分析物傾向於留在流動相中，會更快的從柱子上洗脫下來。
然後，不同的化合物可能對溫度變化有不同響應程度的保留時間改變。更加確切的說，它們的范德霍夫線的斜率不同（ln k與1/T，T以絕對溫度計量）；換句話說，α值會變化。
另外溫度增加會使低k值的色譜峰出峰更快,甚至接近在無保留物質的t0附近出來,導致很難進行定量分析。
以analgesics(一種鎮痛藥，譯者註)為例，圖二顯示的一系列的色譜圖列出了七種鎮痛藥在柱溫20-90°C的分離情況。我們從中可以發現許多特點。
首先，所有分析物隨著溫度升高，保留時間變短且峰變窄，意味溫度升高利於分離效果。其次，鎮痛藥之一的水楊酸（即阿司匹林）在峰5，6之間，隨著溫度變化位置改變較大。事實是在20-40°C時，該物質隨溫度變化，洗脫順序也發生了變化。在中間的30℃時，水楊酸和第6號峰的非那西丁一起出峰。可以看出，溫度大於40°C會引起分離時間變短和洗脫順序發生變化。
當然，還有一個提高溫度的好處在於降低了操作時的柱壓，以便於使用更大的流速和粒徑更小的填料。
另一個在高溫下能夠影響色譜柱性能的因素是流動相的溫差。如果柱子在60°C下操作，但是流動相在室溫流入，那麼進入的較冷的流動相就能夠引起峰變形，原因是不同溫度下分析物會趨向在高溫的流動相中。所以建議大家在較高溫度下使用色譜柱的時一定記得預熱流動相。
神話五：載碳量越高，反相色譜柱性能就越好
錯誤！
就普通的烷基鍵合相色譜柱而言，這樣的結論看來是對鏈長、載碳量和表面鍵合度等概念有誤解。
通常，對一個真正的反相保留機制來說，保留能力取決於被分析分子的相對疏水性，所以保留一般取決於載碳量。載碳量越高，保留能力越強。載碳量一般與鏈長成正比，但並不是必然如此。
典型的色譜矽膠表面，可用於和有機矽烷試劑鍵合反應的矽醇基含量在8.0 μmol/m2左右。假設在所有的矽醇基上都能做到單層鍵合，則鏈長越長，載碳量就越大，結果是保留能力與鏈長成正比。然而，雖然是短鏈鍵合相（比如C8），如果表面鍵合度相對更高，那麼鍵合的碳就會更多，就會導致可能比C18有更加強的保留能力。
此外，一些廠家使用二氯矽烷和三氯矽烷做鍵合試劑，由於聚合反應的發生通常能增加固定相的鍵合率。這種情況下，短鏈聚合鍵合相會比長鏈單體鍵合相的鍵合度高很多。
對比單體鍵合相，聚合鍵合相的鍵合層較厚，有時會引起傳質速度變慢。
高載碳量的反相柱更加容易發生相塌陷（或更確切地稱固定相失濕）。對於這些柱子，當流動相中有機相比例降到10%以下的時候，類油的疏水固定相之間就會傾向於互相結合（self-associate），而不是處於在極性水溶液中的溶解狀態（即相似相溶）。所以，在此情況下，高載碳量反而可能對反相色譜柱性能有害，而且保留時間的重現性也不好。
下節預告：
神話六：小粒徑填料色譜柱的柱效總是相對更高
神話七：對於矽膠填料，殘留的矽醇基是造成拖尾的原因
神話八：矽膠基質填料只能夠在pH2到7使用
神話九：當代HPLC柱至少應該承受1000次進樣
神話十：色譜柱總是應該密封緊密，以防填料因與空氣接觸而損壞
原文出處：
Ronald E. Majors,”Top HPLC Column Myths”，LCGC North America ,Volume 24, Issue 11 (Nov 01, 2006) , pg 1172–1182
Ron Majors, editor of “Column Watch” and “Sample Prep Perspectives,” has been withLCGC North Americafor over 26 years. Currently a senior scientist with Agilent Technologies, Wilmington, Delaware, Ron is known industry-wide as one of the premier chromatography experts in the field. He is also a member ofLCGC’s editorial advisory board.
譯者：
姚立新
納譜分析技術（蘇州）有限公司總經理
曾任國內知名色譜耗材公司的聯合創始人及副總經理，成功開發過多系列的色譜耗材產品並做到其規模化生產和銷售。擁有7項已授權的中國國家發明專利，發表論文20餘篇。熟知國內色譜耗材市場行情和發展趨勢，在該領域有十多年的市場行銷管理經驗。
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