以治愈為目標：詳解HBV感染治療策略

目前，已有疫苗來降低乙肝的 新髮感染率，以及核苷（酸）類似物已延緩慢乙肝患者的肝病進展。但學界仍不滿於此，仍堅持探索乙型肝炎病毒（HBV）的感染機制和新的藥物靶點，以治愈乙肝為目的，開發新的抗病毒藥物和免疫干預措施。

為此，The Lancet Gastroenterology & Hepatology與Nature Reviews Drug Discovery分別發表了一篇綜述，詳細闡述了HBV的生命周期，並回顧了目前不同的藥物研發策略。以下是這兩篇綜述的主要內容。

HBV病毒學和生命周期

了解HBV的生命周期非常重要，因為每一步都是藥物開發的潛在靶點。

乙型肝炎病毒（HBV）是嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）家族的成員。HBV感染肝細胞後，開始建立自己的復制周期，並在細胞核中持續存在。

HBV病毒粒子是以脂質為基礎的球形結構，直徑約為42-47 nm，三種不同的表面抗原（HBsAg）暴露於其外側，分別為小（S）、中（M）、大（L）病毒包膜蛋白（viral envelope proteins）（圖1）。

圖1 HBV病毒粒子結構（來源：參考文獻1）

HBV生命周期如圖2所示。

HBV的生命周期：（1）HBV與NTCP受體結合後感染肝細胞；（2）HBV核衣殼運至細胞核，rcDNA進入細胞核，並整合到人類基因組中；（3）rcDNA經宿主因子轉化為cccDNA，形成穩定的cccDNA；（4）以cccDNA為模板轉錄生成病毒RNA；（5）病毒RNA被翻譯成HBV蛋白；（6）連接HBV聚合酶的pgRNA被包裝成衣殼顆粒；（7）以pgRNA為模板逆轉錄生成DNA負鏈；（8）隨後生成DNA正鏈；（9）HBV病毒顆粒和非感染性亞病毒顆粒的形成和分泌。

圖2 HBV的生命周期（來源：參考文獻1）

大包膜蛋白包含參與病毒進入（viral entry）的受體結合域，在感染時，該受體結合域與人牛磺膽酸鈉共轉運多肽受體（hNTCP或SLC10A1）相互作用——後者在肝細胞上表達。這種相互作用使病毒通過內吞作用進入肝細胞，並將HBV核衣殼（nucleocapsid）釋放到肝細胞質中。所以，可通過阻斷病毒與NTCP受體的相互作用，阻止HBV進入肝細胞來預防感染。

HBV的核衣殼由HBV核心蛋白二聚體（HBc）組成，包含部分雙鏈DNA基因組，後者呈鬆弛環狀構象（鬆弛雙連環狀DNA，rcDNA）。這個rcDNA長度約為3.2kb，與HBV聚合酶共價連接。在DNA鏈的5ʹ末端有一個來自前基因組RNA（pgRNA）的RNA引物，對病毒的逆轉錄來說十分重要。

在感染細胞的胞質中，病毒核衣殼運輸至核膜，並釋放rcDNA進入細胞核。

rcDNA可以整合到宿主基因組中，通過基因組改變導致癌症的發生。這種整合在HBV復制周期中沒有直接作用，但可以作為HBsAg分泌的模板。rcDNA被宿主DNA修復轉化為共價閉合環狀DNA（cccDNA）。cccDNA與宿主組蛋白結合，形成一個穩定的小染色體，作為所有病毒轉錄的轉錄模板。

當翻譯出病毒蛋白後，HBV聚合酶與pgRNA相互作用，同時，核心蛋白（HBc）與pgRNA相互作用，啟動新核衣殼的組裝。

被衣殼包裹的pgRNA逆轉錄成rcDNA，作為病毒合成的DNA負鏈模板（正鏈稍後合成）。最後生成新的核衣殼（nucleocapsid），其可以返回細胞核，並被循環利用以擴充cccDNA池。

另外，核衣殼可與與內質網結合，HBsAg在內質網聚集，並通過分泌途徑排出細胞。HBsAg的過量產生導致非感染性亞病毒顆粒的分泌，後者在免疫逃避中起重要作用。

直接抗病毒治療策略

HBV生命周期的所有步驟都有可能成為抗病毒治療的靶點（圖3）。

註：RNAi=RNA干擾；Pol=HBV聚合酶；NUCs=核苷（酸）類似物；CpAMs=衣殼組裝抑制劑。

圖3 HBV治療策略的示意圖（來源：參考文獻1）

1. 防止HBV進入細胞（Preventing HBV entry）

病毒不斷地復制和釋放可導致新的肝細胞被感染，從而維持慢性感染狀態並擴充cccDNA池。在大多數患者中，核苷（酸）類似物（NUC）治療不能完全抑制病毒產生。因此，聯用病毒進入抑制劑和復制抑制劑，是阻止新細胞受到感染，並減少cccDNA池的潛在手段。

防止病毒進入的策略包括開發HBsAg衍生的多肽，如Myrcludex B，其可通過與NTCP受體競爭性地結合，阻礙HBV病毒進入細胞。

除了多肽以外，小分子藥物如ezetimibe和環孢素衍生物也在研究中被用於阻斷HBV進入細胞。另外，HBV的病毒進入也受到靶向HBsAg的單克隆抗體影響，這些抗體還可能具有額外的抗病毒活性，其可以干擾血清HBsAg和感染性病毒的分泌。

丁肝病毒（HDV）利用HBV包膜，因此使用的是相同的病毒進入受體。HBV病毒進入抑制劑對同時感染HBV和HDV的患者有很大的益處。

2. 直接靶向cccDNA（Directly targeting cccDNA）

抑制cccDNA的形成是一有力的直接抗病毒策略。然而，在開發相關藥物之前，需要對cccDNA的形成過程有更全面的了解。

cccDNA形成的許多關鍵步驟需要宿主細胞核中的酶（包括TDP2、FEN1和POLK），而病毒微型染色體（minichromosome）的形成需要宿主染色質的組蛋白和其他成分。因此，若要抑制cccDNA的形成可能需要靶向宿主蛋白，由此會造成更多不良反應。

cccDNA形成後，就可以被鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases）或轉錄激活因子樣效應核酸酶（transcription activator- like effector nucleases）靶向，這些酶已在細胞培養模型中成功用於編輯HBV cccDNA。

基於CRISPR–Cas9的基因編輯策略——在cccDNA中加入突變或者敲除某一基因，可能導致cccDNA失活。臨床前實驗表明，超過90%的HBV DNA可被Cas9裂解。然而，大約7%的cccDNA基因組在經過CRISPR-Cas9介導的切割之後，能夠被修復成不影響cccDNA功能的狀態。因此，這一策略需要引入靶向cccDNA中不同位點的多個指導RNA（gRNA），確保cccDNA的失活。在這些基因編輯方法應用於臨床之前，還需要解決潛在的問題，包括肝細胞遞送、脫靶效應、由於染色體整合HBV DNA的裂解和染色體DNA重組而導致不可預測的後果。盡管存在這些問題，但目前這是唯一一種在組織中讓cccDNA永久性失活的方法。

3. 靶向病毒基因表達（Targeting viral gene expression）

高病毒抗原負荷被認為在形成和維持慢性感染中起到重要作用，因此，通過沉默cccDNA轉錄或者降解病毒RNA直接降低病毒抗原和調節蛋白的表達也具有意義。

（1）轉錄前的調控：對cccDNA的轉錄前調控可以通過靶向HBx或HBc來做到，這兩種蛋白都與cccDNA的穩定性和表達有關。

（2）轉錄後的調控：可使用RNA干擾（RNAi）、反義寡核苷酸（ASOs）來降解HBV mRNA。普遍的觀點是，靶向HBV mRNA是治療的一個重要緩解，因為這將限制cccDNA產生HBsAg，從而有助於恢復患者特異性免疫。

4. 抑制衣殼組裝（Capsid assembly）

與NUCs單獨治療相比，衣殼組裝抑制劑與NUCs聯合使用可能會進一步降低病毒水平，並有更利於患者HBV特異性免疫重建。目前抑制衣殼組裝的小分子化合物可以分為兩類：（1）核蛋白異構調節劑（CpAMs），如GLS4和RO7049389，可以導致非衣殼核蛋白多聚體的組裝錯誤；（2）衣殼組裝調節劑，如AT-130、NVR-3778、JNJ6379等，可以形成形態正常的衣殼，但病毒核酸缺失。

5. 靶向HBsAg的釋放（HBsAg release）

核酸聚合物（nucleic acid polymers, NAPs）具有抗病毒作用並可抑制受感染肝細胞釋放HBsAg，不過其具體的抗病毒作用機制尚未被闡明。

免疫調節療法

通過適當地激活抗病毒免疫，可以做到HBV的功能性治愈。若患者HBV得到控制，其特徵便是抗HBV特異性體液和細胞免疫的協調激活。激活宿主免疫機制使HBV感染自發性清除，也是一種慢乙肝治療手段。

1. 靶向先天性免疫力的策略

靶向先天性免疫力主要是利用細胞因子（TNF、IFNα、IFNγ、IL-1β）的直接抗病毒效應，從而誘導適應性免疫。IFNα療法就是基於這個原理，該療法對少數CHB患者（約5%-10%）有效，在這些患者中可做到真正的功能性治愈。此外，IFNα還提高NK細胞的免疫應答能力，接受IFNα治療後達到HBsAg陰性的患者恢復了HBV特異性T細胞反應。

抗病毒細胞因子不僅可以減少HBV的復制，還可以消除cccDNA——這是治愈CHB最直接有效的策略。

2. 靶向適應性免疫力的策略

HBV特異性免疫在CHB患者中存在缺陷，理論上可以通過免疫檢測點抑制劑（如抗PD1或抗CTLA-4療法）或治療性疫苗來恢復。阻斷PD1-PDL1相互作用的抗體可部分恢復缺陷的HBV特異性T/B細胞應答。抗PD1治療對CHB患者的抗病毒活性有限，但仍需根據其病毒學和臨床特徵選擇合適的患者，抗PD1抗體的最佳劑量也有待確定。

結語

綜上所述，新的乙肝治療策略旨在做到功能性治愈，持續的治療後達到HBsAg的消失。

參考文獻：

[1] Tarik Asselah, Dimitri Loureiro, Nathalie Boyer, Abdellah Mansouri. Targets and future direct-acting antiviral approaches to achieve hepatitis B virus cure. Lancet Gastroenterol Hepatol (2019); 4: 883–892.

[2] Gregory C. Fanning, Fabien Zoulim, Jinlin Hou, Antonio Bertoletti. Nature Reviews Drug Discovery (2019). DOI:

https://doi.org/10.1038/s41573-019-0037-0