生物鐘基因與非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 指除外酒精和其他明確損肝因素所致的, 以肝細胞脂肪變性和脂質沉積為特徵的臨床病理綜合征。其組織學亞型——非酒精性脂肪性肝炎作為重要的肝纖維化前期病變，如未行積極診治，可逐漸進展為肝硬化，甚至肝癌等終末期肝病。NAFLD已經成為最普遍的慢性肝病之一。流行病學研究發現全球NAFLD患病率為2524%，亞洲人NAFLD患病率為27.37%，且亞洲NAFLD患者肥胖症的患病率為67%。目前大陸NAFLD患病率呈明顯上升趨勢，因此明確其發病機制並積極進行防治十分重要。

1 生物鐘概述

1.1 生物鐘的形成

生物鐘是生物體為適應外在環境而在長期的進化過程中形成的內在節律。地球自轉使得晝夜交替，生物體為了適應光照、溫度等變化而出現一系列的生理和行為變化。哺乳動物體內的生物鐘分別由中樞生物鐘（下丘腦視交叉上核，SCN）和外周生物鐘(肝、腸、腎、心和脾）組成，SCN起著主要的調控作用，也稱為核心鐘，它們共同調控生物體的各種生理和行為活動。SCN通過直接接收來自視網膜的光輸入來感知一天中的時間，使得中樞生物鐘相位與光相位同步，晝夜節律周期達到24 h。通過神經和體液信號，SCN將此信息發送到大腦其他區域和外周生物鐘，這些生物鐘幾乎存在於身體其他部分的所有細胞中，並將它們同步到同一階段。中樞生物鐘節律僅對光照/黑暗變化發生反應，而外周生物鐘節律不但可受中樞生物鐘的調控，其自身還能根據某些外部環境影響（如溫度、飲食控制和進食時間）達到自我調控，從而達到機體自我保護的穩態平衡。

1.2 生物鐘的分子調控機制

生物鐘在分子水平上由多個生物鐘基因精確調控，如circadian locomotor output cycles kaput(CLOCK)、brain and muscle arylhydrocarbo receptor nuclear translocator(ARNT)-like protein-1(BMAL1)、period(Per, Per1、Per2、Per3)、cryptochrome(Cry, Cry1、Cry2）、neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 2(NPAS2)、nuclear receptor subfamily 1 group D member 1(NR1D1,也稱Rev-Erbα)、peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARα)等。

生物鐘基因CLOCK通過bHLH-PAS結構域與BMAL1形成異源二聚體，同Per和Cry基因啟動子上的E盒相結合併激活其轉錄，表達產物Per和Cry系列蛋白由細胞胞漿轉移至胞核內，作為負性元件與CLOCK/BMAL1直接結合併抑制其活性，進而阻遏Per和Cry的進一步轉錄；CLOCK與BMAL1形成的異二聚體除了激活Per和Cry基因轉錄外，也激活了孤兒核受體Rev-Erb基因的轉錄。Rev-Erb基因編碼蛋白可與BMAL1啟動子相結合併阻遏其轉錄。生物鐘基因這種負反饋循環結構形成人體內精確的內源性「分子鐘」，並通過其下遊的鐘控基因將生物鐘的節律信號輸出，從而使細胞內的分子活動也呈現出時間節律。

2 NAFLD發病機制

目前NAFLD的發病機制尚未明確，但已經完成從 「二次打擊學說」到「多重打擊模型」的演變。「多重打擊模型」認為第一次打擊仍是由胰島素抵抗（IR）引發肝臟脂質沉積，但第二次打擊僅由氧化應激及脂質過氧化損傷概括似乎難以解釋NAFLD的複雜性。脂代謝紊亂引起肝臟脂質沉積是NAFLD 的重要病因，IR使胰島素抑制脂肪分解作用減弱，引起血漿遊離脂肪酸（FFA）濃度升高，被肝細胞攝取後甘油三酯合成增多，促使脂質沉積。肝臟積累的脂質分子又通過干擾細胞胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化和信號轉導加重IR。IR與脂代謝紊亂相互影響，共同推動NAFLD病程進展。在IR與FFA增多的基礎上，微粒體內的脂質過氧化物酶上調，線粒體內的β氧化作用增強，導致肝臟對氧化應激更加敏感，從而增加了肝臟受損的程度。線粒體活性氧反應產物的改變會促進體內氧化還原反應的一系列變化,而這些變化會改變氨基末端激酶的活性，並且擾亂胰島素信號。

此外，FFA水平上升可導致脂毒性和IR，並與其他因素（如腸源性內毒素）一起促進炎症因子IL-6、TNFα、IL-4等的釋放，肝臟長期暴露於高水平炎症因子可導致與非酒精性脂肪性肝炎相似的組織學變化，並且IL-6、TNFα等能夠使脂聯素水平降低和瘦素水平升高，脂聯素具有抗炎、抗動脈粥樣硬化及抗糖尿病的特性，瘦素水平增高可導致慢性炎症在肥胖患者中的循環永久化。菌群失調或腸道屏障破壞會增加細菌流入肝臟，從而通過激活Toll樣受體和其他模式識別受體來促進炎症反應。此外，NAFLD發病還與飲食因素及遺傳因素相關。這些因素相互影響、共同作用，導致NAFLD的發生。

3 生物鐘基因表達對脂代謝的影響

研究發現Per2基因敲除小鼠空腹血糖降低，肝糖原積累減少，血漿胰島素水平升高,糖異生受損，並且血脂水平降低，在高脂飲食下體質量增加較野生型更為明顯。這說明生物鐘基因Per2不僅在調節基因表達中起作用，對新陳代謝也有重要影響。此外，Per2可以特異性地抑制PPARγ，PPARγ是氧化應激、炎症反應、葡萄糖及脂質代謝的關鍵核受體，缺乏PER2基因會影響脂質代謝，其特徵在於血漿甘油三酯和FFA的快速減少。生物鐘基因Per2在脂肪肝肝組織中的表達明顯低於正常肝組織，NAFLD患者肝細胞PPARγ和aP2高表達，肝組織中增多的FFA和類花生酸與PPARγ相互作用，可激活生物鐘基因上遊的調節元件從而調節BMAL1的活性。PPARα激活肝臟中的BMAL1和Rev-Erbα, PPAR的配體包括各種類型的脂質，其中在小腸中產生和釋放的腸道循環代謝產物油酰乙醇胺，在PPARα依賴下,休息期間可抑制食物攝入。Rev-Erbα是一種調節脂質代謝和脂肪生成的核受體，受生物鐘調節並抑制BMAL1表達。Rev-Erbα和Rev-Erbβ雙敲的小鼠會出現血糖和甘油三酯水平升高，但是FFA水平降低，FFA降低可反映氧化代謝的增加。Rev-Erbs基因可通過調控INSIG2-SREBP信號通路參與脂質代謝。

多項研究發現Cry1或Cry2基因敲除小鼠葡萄糖不耐受，皮質酮水平升高，肝臟中糖皮質激素（GC）反式激活增加，脂肪生成和類固醇生成途徑改變，以及身體生長和肝臟再生受損。Cry1可通過阻斷胰高血糖素的腺苷酸環化酶信號傳導來抑制肝臟糖異生，Cry1和Cry2雙敲除動物的糖異生增加。

CLOCK或BMAL1敲除小鼠會出現葡萄糖耐量降低，胰島素分泌減少，胰島增殖缺陷，且症狀隨著年齡的增長而加重。肝臟特異性敲除BMAL1可導致肝臟的關鍵代謝基因振蕩喪失，引起糖異生受損、葡萄糖過度清除和靜息期間的低血糖，並加重肝細胞氧化損傷、誘發IR；胰腺特異性BMAL1敲除則導致高血糖、葡萄糖耐量降低及由於β細胞增殖和胰島素顆粒胞吐作用導致的胰島素減少，因此，組織特異性生物鐘在胰島和肝臟中具有不同的作用，影響相反的代謝過程，從而在餵食和禁食期間促進葡萄糖穩定性。恢復高脂飲食小鼠的BMAL1活性能逆轉線粒體的腫脹形態並改善線粒體功能。由上述研究可知生物鐘基因與脂質代謝密切相關。

4 生物鐘基因調控影響GC水平

作為全身晝夜節律的夾帶信號，GC節律在協調糖、脂質和蛋白質代謝中起關鍵作用。在無壓力條件下，循環中的GC水平顯示出在活躍期開始時的強烈日常節律性峰值（即人類的早晨和夜間嚙齒動物的夜晚）。GC晝夜節律由中樞和外周生物鐘協調。SCN控制下丘腦-垂體-腎上腺軸的晝夜節律功能，以誘導GC的節律性產生和分泌。肝臟、脂肪組織和腎臟中的外周時鐘由SCN通過自主神經系統和有節奏的夾帶信號（例如GC）調節。

研究發現GC和進食模式的晝夜節律在Per2基因敲除小鼠中變得紊亂。Cry1和Cry2可以以配體依賴性方式與糖皮質激素受體（GR）的C末端結構域相互作用，抑制GR介導的某些靶基因的反式激活。Cry1和Cry2的缺失導致GR介導的GC合成受損。缺乏Cry1或Cry2的小鼠在注射葡萄糖後恢復正常血糖的能力也顯著受損。CLOCK/BMAL1異二聚體與GR相互作用，從而降低其對GC反應元件的親和力及其向細胞核的易位。此外，Rev-Erbα可以通過與熱休克蛋白90的相互作用來穩定GR的核定位，從而增強其轉錄活性。通過這種複雜的相互作用網路，GR最終在生理反應中轉化環境信息。

5 生物鐘基因與氧化應激變化

環磷酸腺苷不僅僅是SCN的輸出，還是SCN起搏器的一個組成部分，調節轉錄周期。細胞能量狀態也影響氧化還原狀態，食物攝入通過該途徑可能影響晝夜節律。實際上，體外實驗已經表明，煙酰胺腺嘌呤二核苦酸的氧化還原狀態可以調節CLOCK/BMAL1異二聚體的DNA結合活性，這表明細胞氧化還原變化可能足以改變生物鐘。體內NAD水平受到晝夜節律的影響，從而為生物鐘提供有節奏的輸入,但也有一些間接途徑，氧化還原狀態可通過這些途徑與時鐘相關聯。最近的研究進一步確定了細胞氧化還原狀態的24 h節律，其控制過氧化物酶抗氧化酶家族氧化態的晝夜節律振蕩。有研究發現參與脂質和葡萄糖代謝的線粒體限速酶依賴Per1和Per2蛋白的調控，Per1/2缺乏或高脂飲食的小鼠會出現線粒體呼吸調節遲鈍。這些研究提出了細胞氧化還原狀態的振蕩可能控制代謝過程的晝夜節律並且可能獨立於生物鐘轉錄反饋環。

6 展望

綜上，目前許多研究已證實生物鐘基因紊亂可導致與NAFLD發病密切相關的脂代謝異常、氧化應激、IR、GC分泌異常等，但生物鐘基因紊亂是否能成為NAFLD發生發展過程中的又一打擊因素，其機制仍有待繼續探索。

參考文獻

［1］ESLAM M, GEORGE J. Genetic and epigenetic mechanisms of NASH［J］. Hepatol Int, 2016, 10(3): 394-406.

［2］YANG YL, ZHENG LY, GU WM, et al. Effect of total glucosides of paeony regulate HMGB1，ＲAGE pathway on nonalcoholic fatty liver disease in rats［J］. Chin J Clin Pharmacol Ther, 2017, 22(6): 611-616. (in Chinese)

楊以琳, 鄭琳穎, 古偉明, 等. 白芍總苷對非酒精性脂肪性肝病大鼠HMGB1、RAGE通路的調控作用［J］. 中國臨床藥理學與治療學, 2017, 22(6): 611-616.

［3］YOUNOSSI ZM, KOENIG AB, ABDELATIF D, et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes［J］. Hepatology, 2016, 64(1): 73-84.

［4］MENG YL, ZHANG HY, SONG BG, et al. An investigation of the prevalence rate of fatty liver disease among people undergoing physical examination in Tangshan, China［J］. J Clin Hepatol, 2017, 33(12): 2376-2380.（in Chinese）

孟昱林， 張海艷， 宋寶國， 等. 唐山市體檢人群脂肪肝患病率調查分析［J］. 臨床肝膽病雜誌, 2017, 33(12): 2376-2380.

［5］DIBNER C, SCHIBLER U, ALBRECHT U. The mammalian circadian timing system: Organization and coordination of central and peripheral clocks［J］. Annu Rev Physiol, 2010, 72: 517-549.

［6］MOHAWK JA, GREEN CB, TAKAHASHI JS. Central and peripheral circadian clocks in mammals［J］. Annu Rev Neurosci, 2012, 35: 445-462.

［7］GLASER FT, STANEWSKY R. Synchronization of the drosophila circadian clock by temperature cycles［J］. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2007, 72: 233-242.

［8］DAMIOLA F, LE MINH N, PREITNER N, et al. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus［J］. Genes Dev, 2000, 14(23): 2950-2961.

［9］KING DP, ZHAO Y, SANGORAM AM, et al. Positional cloning of the mouse circadian clock gene［J］. Cell, 1997, 89(4): 641-653.

［10］LANDOLT HP. CIRCADIAN RHYTHMS. Caffeine, the circadian clock, and sleep［J］. Science, 2015, 349(6254): 1289.

［11］CHO H, ZHAO X, HATORI M, et al. Regulation of circadian behaviour and metabolism by REV-ERB-alpha and REV-ERB-beta［J］. Nature, 2012, 485(7396): 123-127.

［12］BERSTEN DC, SULLIVAN AE, PEET DJ, et al. bHLH-PAS proteins in cancer［J］. Nat Rev Cancer, 2013, 13(12): 827-841.

［13］MAZZOCCOLI G, PAZIENZA V, VINCIGUERRA M. Clock genes and clock-controlled genes in the regulation of metabolic rhythms［J］. Chronobiol Int, 2012, 29(3): 227-251.

［14］WILLEBRORDS J, PEREIRA IV, MAES M, et al. Strategies, models and biomarkers in experimental non-alcoholic fatty liver disease research［J］. Prog Lipid Res, 2015, 59: 106-125.

［15］FANG YL, CHEN H, WANG CL, et al. Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease in children and adolescence: From 「two hit theory」 to 「multiple hit model」［J］. World J Gastroenterol, 2018, 24(27): 2974-2983.

［16］ONYEKWERE CA, OGBERA AO, SAMAILA AA, et al. Nonalcoholic fatty liver disease: Synopsis of current developments［J］. Niger J Clin Pract, 2015, 18(6): 703-712.

［17］WEI GC, HE JY. Traditional Chinese medicine intervention to nonalcoholic fatty liver disease based on physique identi cation［J］. J Changchun Univ Chin Med, 2018, 34(3): 518-521. (in Chinese)

魏功昌, 何瑾瑜. 中醫體質辨識治療非酒精性脂肪性肝病［J］. 長春中醫藥大學學報, 2018, 34(3): 518-521.

［18］REBRIN K, STEIL GM, MITTELMAN SD, et al. Causal linkage between insulin suppression of lipolysis and suppression of liver glucose output in dogs［J］. J Clin Invest, 1996, 98(3): 741-749.

［19］SHULMAN GI. Ectopic fat in insulin resistance, dyslipidemia, and cardiometabolic disease［J］. N Engl J Med, 2014, 371(23): 2237-2238.

［20］SACHDEV MS, RIELY CA, MADAN AK. Nonalcoholic fatty liver disease of obesity［J］. Obes Surg, 2006, 16(11): 1412-1419.

［21］CARDOSO AR, CABRAL-COSTA JV, KOWALTOWSKI AJ. Effects of a high fat diet on liver mitochondria: Increased ATP-sensitive K+ channel activity and reactive oxygen species generation［J］. J Bioenerg Biomembr, 2010, 42(3): 245-253.

［22］FELDSTEIN AE, WERNEBURG NW, CANBAY A, et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF-alpha expression via a lysosomal pathway［J］. Hepatology, 2004, 40(1): 185-194.

［23］TOMITA K, TAMIYA G, ANDO S, et al. Tumour necrosis factor alpha signalling through activation of Kupffer cells plays an essential role in liver fibrosis of non-alcoholic steatohepatitis in mice［J］. Gut, 2006, 55(3): 415-424.

［24］PAZ-FILHO G, MASTRONARDI C, FRANCO CB, et al. Leptin: Molecular mechanisms, systemic pro-inflammatory effects, and clinical implications［J］. Arq Bras Endocrinol Metabol, 2012, 56(9): 597-607.

［25］KAPIL S, DUSEJA A, SHARMA BK, et al. Small intestinal bacterial overgrowth andtoll-like receptor signaling in patients with non-alcoholic fatty liver disease［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2016, 31(1): 213-221.

［26］LANASPA MA, SANCHEZ-LOZADA LG, CHOI YJ, et al. Uric acid induces heaptic steatosis by generation of mitochondrial oxidative stress: Potential role in fructose-dependent and -independent fatty liver［J］. J Biol Chem, 2012, 287(48): 40732-40744.

［27］GIUDICE EM, GRANDONE A, CIRILLO G, et al. The association of PNPLA3 variants with liver enzymes in childhood obesity is driven by the interaction with abdominal fat［J］. PLoS One, 2011, 6(11): e27933.

［28］ZANI F, BREASSON L, BECATTINI B, et al. PER2 promotes glucose storage to liver glycogen during feeding and acute fasting by inducing Gys2 PTG and G L expression［J］. Mol Metab, 2013, 2(3): 292-305.

［29］GRIMALDI B, BELLET MM, KATADA S, et al. PER2 controls lipid metabolism by direct regulation of PPARgamma［J］. Cell Metab, 2010, 12(5): 509-520.

［30］ZHOU D, WANG Y, CHEN L, et al. Evolving roles of circadian rhythms in liver homeostasis and pathology［J］. Oncotarget, 2016, 7(8): 8625-8639.

［31］MARION-LETELLIER R, SAVOYE G, GHOSH S. Fatty acids, eicosanoids and PPAR gamma ［J］. Eur J Pharmacol, 2016, 785: 44-49.

［32］YANG G, JIA Z, AOYAGI T, et al. Systemic PPARgamma deletion impairs circadian rhythms of behavior and metabolism［J］. PLoS One, 2012, 7(8): e38117.

［33］LI S, LIN JD. Molecular control of circadian metabolic rhythms［J］. J Appl Physiol (1985), 2009, 107(6): 1959-1964.

［34］FU J, GAETANI S, OVEISI F, et al. Oleylethanolamide regulates feeding and body weight through activation of the nuclear receptor PPAR-alpha［J］. Nature, 2003, 425(6953): 90-93.

［35］CHO H, ZHAO X, HATORI M, et al. Regulation of circadian behaviour and metabolism by REV-ERB-alpha and REV-ERB-beta［J］. Nature, 2012, 485(7396): 123-127.

［36］TAHARA Y, SHIBATA S. Circadian rhythms of liver physiology and disease: Experimental and clinical evidence［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2016, 13(4): 217-226.

［37］LAMIA KA, PAPP SJ, YU RT, et al. Cryptochromes mediate rhythmic repression of the glucocorticoid receptor［J］. Nature, 2011, 480(7378): 552-556.

［38］SUN S, ZHOU L, YU Y, et al. Knocking down clock control gene CRY1 decreases adipogenesis via canonical Wnt/beta-catenin signaling pathway［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 506(3): 746-753.

［39］ZHANG EE, LIU Y, DENTIN R, et al. Cryptochrome mediates circadian regulation of cAMP signaling and hepatic gluconeogenesis［J］. Nat Med, 2010, 16(10): 1152-1156.

［40］MARCHEVA B, RAMSEY KM, BUHR ED, et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes［J］. Nature, 2010, 466(7306): 627-631.

［41］LAMIA KA, STORCH KF, WEITZ CJ. Physiological significance of a peripheral tissue circadian clock［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(39): 15172-15177.

［42］JACOBI D, LIU S, BURKEWITZ K, et al. Hepatic bmal1 regulates rhythmic mitochondrial dynamics and promotes metabolic fitness［J］. Cell Metab, 2015, 22(4): 709-720.

［43］DUMBELL R, MATVEEVA O, OSTER H. Circadian clocks, stress, and immunity［J］. Front Endocrinol (Lausanne), 2016, 7: 37.

［44］ASTIZ M, OSTER H. Perinatal programming of circadian clock-stress crosstalk［J］. Neural Plast, 2018, 2018: 5689165.

［45］YANG S, LIU A, WEIDENHAMMER A, et al. The role of mPer2 clock gene in glucocorticoid and feeding rhythms［J］. Endocrinology, 2009, 150(5): 2153-2160.

［46］RUTTER J, REICK M, WU LC, et al. Regulation of clock and NPAS2 DNA binding by the redox state of NAD cofactors［J］. Science, 2001, 293(5529): 510-514.

［47］ASHER G, SCHIBLER U. Crosstalk between components of circadian and metabolic cycles in mammals［J］. Cell Metab, 2011, 13(2): 125-137.

［48］KIL IS, LEE SK, RYU KW, et al. Feedback control of adrenal steroidogenesis via H2O2-dependent, reversible inactivation of peroxiredoxin III in mitochondria［J］. Mol Cell, 2012, 46(5): 584-594.

［49］NEUFELD-COHEN A, ROBLES MS, AVIRAM R, et al. Circadian control of oscillations in mitochondrial rate-limiting enzymes and nutrient utilization by PERIOD proteins［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016, 113(12): e1673-e1682.

終於被你滾到底了

點擊下方「閱讀原文」，下載本文完整PDF

引證本文：艾燕, 楊小倩,潘曉莉,等. 生物鐘基因在非酒精性脂肪性肝病發生發展中的作用[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2019, 35(10): 2327-2330.

本文編輯：林姣

公眾號編輯：邢翔宇