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文 / 叨叨一下

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本文經授權轉自微信公眾號唯信計算。

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引言

本文是2016年發表在Nat Rev Drug Discov的綜述，詳細介紹了兩種冠狀病毒SARS和MERS的藥物發現和治療策略，希望對當前武漢新型冠狀病毒的藥物研發有所借鏡與幫助。

背景介紹

冠狀病毒（Coronaviruses, CoV）是一組高度多樣的、包膜的、陽性的單鏈RNA基因,序列大小約為26～32 kb, 具化有5’端的甲基化帽子和3’端的聚腺苷酸尾部，結構形態上類似皇冠，膜表面有三種糖蛋白：刺突糖蛋白spike glycoprotein (S)、包膜蛋白envelope protein (E), 膜糖蛋白mem-brane protein (M)
和核衣殼蛋白nucleocapsid protein (N)。之前爆發過兩次嚴害危害人類健康的冠狀病毒，分別是2003的嚴重急性呼吸綜合征(SARS)和2012年的中東呼吸綜合征(MERS)。可在人類及多種動物中引起不同程度的呼吸、腸道、肝臟和神經系統疾病 。

SARS和MERS的流行病學分析

SARS.
在2002年11月，廣東省佛山市發生一起非典型肺炎疫情，醫院感染率高2003年3月，一種新型冠狀病毒被證實是SARS的病原體，被命名為SARS-CoV。2003年7月疫情結束時，感染SARS-CoV共8098例，死亡774人。通過血清學研究和病毒基因序列分析顯示，從蝙蝠中分離出與人類SARS病毒序列高度相似（88-95%）的冠狀病毒，表明蝙蝠可能是SARS冠狀病毒近緣祖先的天然宿主 。

MERS.
在2012年6月，從一位死於嚴重肺炎和多器官衰竭的沙烏地阿拉伯患者中分離出一種新型的β-CoV，被稱為中東呼吸綜合征（MERS）。截至2015年10月9日，世界衛生組織報告了1593例經實驗室確診的MERS病例，包括568例死亡。MERS-CoV主要是一種人畜共患病病毒，具有非持續性人與人之間傳播的能力。血清學和病毒學研究表明，駱駝和蝙蝠是MERS-Co最可能的動物宿主。MERS-CoV的人與人傳播發生於防范不到位的醫療場所和家庭聚集。

SARS和MERS的臨床特征

這兩種疾病都有主要的呼吸系統表現，但嚴重的病例可能出現肺外症狀。值得注意的是，早期治療對嚴重MERS患者尤其重要，因為這種疾病發展到呼吸窘迫、腎衰竭和死亡的速度比SARS要快得多。MERS相對SARS的病死率高出3到4倍，可能與MERS患者的年齡較高，合併症患病率較高以及兩種疾病的發病機制不同有關。

SARS和MERS的處理策略

器官支持和並發症的預防，特別是急性呼吸窘迫綜合征、器官衰竭和繼發醫院感染，仍然是SARS和MERS最重要的管理策略，因為目前還沒有一種特殊的抗病毒治療方法在隨機對照試驗中被證明是有效的。雖然，許多化合物在細胞培養或動物模型中被發現能抑制SARS-CoV和MERS-CoV的進入和（或）復制，但體外實驗中的活性並不一定能轉化為對人類的有效性。由於SARS和MERS的高發病率和高死亡率，其中一些抗病毒藥物和免疫調節劑被使用（表1），採用這些研究療法需要在當地倫理委員會的批準下，對照研究試驗中應用標準的研究治療方案和系統的臨床和病毒學數據收集。

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抗CoV療法的研究進展

丨新藥開發的關鍵CoV靶點

盡管CoV具有高度的物種多樣性，但它們共享關鍵的基因組，可成為設計抗CoV抑制劑的關鍵靶點。5ʹ末端開放閱讀框（ORF1a/b）編碼的多聚蛋白質（pp1a和pp1ab）可被木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）和3C樣蛋白酶（3CLpro）切割，產生非結構蛋白（NSPs），如RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）和解螺旋酶，參與病毒的轉錄和復制過程（圖2）。

CoV表面結構的棘突糖蛋白（S）在病毒-細胞受體相互作用中起著關鍵作用，對抗病毒藥物的開發具有特殊的意義。棘突糖蛋白由氨基末端受體結合S1和羧基末端膜融合S2亞基組成。為了激活膜融合、病毒進入和合胞體的形成，需要在S1-S2連接處的蛋白酶位點進行切割。S1亞基受體結合域（RBD）與宿主受體的結合，觸發S2亞基（S區）的構象變化，使病毒和細胞膜接近並能融合。針對S1-RBD的單克隆抗體（mAbs）和針對S2亞單位的融合抑制劑在體外和/或體內具有強大的
抗CoV活性。

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宿主受體在決定病毒的致病性、組織傾向性和宿主範圍方面具有重要作用。靶向宿主受體的單克隆抗體或藥物是潛在的抗CoV藥物。人類致病性冠狀病毒利用的關鍵功能性宿主受體包括血管緊張素轉換酶ACE2(SARS-CoV和HCoV-NL63); 二肽基肽酶DPP4(MERS-CoV), 氨基肽酶N (HCoV-229E), O-乙酰化唾液酸 (HCoV-OC43
和HCoV-HKU1)。

CoV通過內質體門路或細胞表面非內質體門路進入宿主細胞,
低pH值和pH依賴性的內質體半胱氨酸蛋白酶等組織蛋白酶類，有助於克服能量不利的膜融合反應，促進CoVs的細胞進入。其他宿主蛋白酶，如跨膜蛋白酶絲氨酸2（TMPRSS2）和TMPRSS11D（也稱為氣道胰蛋白酶樣蛋白酶），可將S切割成S1和S2亞單位，激活S，使細胞表面的非內質體病毒進入質膜。這些蛋白酶的抑制劑可以部分阻斷CoVs細胞進入。MERS-CoV也被弗林蛋白酶（furin）激活，furin是一種絲氨酸內切蛋白酶，參與了融合蛋白的加工和其他RNA病毒的細胞進入（包括HIV、禽流感A/H5N1病毒、伊波拉病毒、馬爾堡病毒和黃病毒）。此外，Furin也參與MERS-CoV的
S1/S2從感染細胞中分離的過程。與多種細胞進入門路有關的宿主蛋白酶抑制劑的單一治療和/或組合治療在體外具有強大的抗CoV活性，不過仍需在動物研究中進一步評估。

CoVs在宿主細胞內解體，將核衣殼和病毒RNA釋放到細胞質中，然後ORF1a/b轉化為pp1a和pp1ab，基因組RNA進行復制。pp1a和pp1ab裂解產生的大量非結構蛋白NSPs，形成復制-轉錄復合物。CoV復制-轉錄復合物的疏水結構域附著在內質網（ER）的限制膜上，產生典型的CoV復制結構，包括雙膜囊泡和卷曲膜。轉錄全長正鏈基因組RNA，形成全長負鏈模板，用於合成新的基因組RNA和重疊的亞基因組負鏈模板。然後合成並翻譯亞基因組mRNAs，產生結構蛋白和輔助蛋白。由核衣殼蛋白（N）和基因組RNA組裝而成的螺旋狀核衣殼與其他結構蛋白相互作用，形成組裝的病毒離子，然後通過胞吐釋放到細胞外室。病毒通過胞吐釋放到細胞外室，重復病毒復制周期。以這些結構基因為靶點的siRNAs可用於CoV感染的治療，進一步優化siRNAs的體內傳遞可能使其臨床應用成為可能。

丨抗CoV藥物開發的三種方法

當2003年SARS-CoV突然出現時，研究人員和研究機構採用了三種通用的方法來發現人類致病性冠狀病毒的潛在抗冠狀病毒治療方案。

第一種方法是測試現有的廣譜抗病毒藥物。包括α干擾素、β干擾素、γ干擾素、利巴韋林和環親素抑制劑。這些藥物具有明顯的優勢，即具有已知的藥代動力學和藥效學特性、副作用和給藥方案。然而，它們沒有特定的抗CoV作用，可能與嚴重的不良反應有關。

第二種方法是篩選已有的化學庫或資料庫。這種方法提供了快速，高通量篩選許多現成的化合物，然後可以進一步評估抗病毒試驗。在非人靈長類動物模型和非隨機臨床試驗中發現抗HIV蛋白酶抑制劑洛匹那韋-利托那韋對抑制CoV有效。這種方法的主要缺點是，盡管許多已鑒定的藥物在體外具有抗CoV活性，大多數不是臨床上有用的，因為它們與免疫抑制作用相幹，或者它們具有抗CoV半數有效濃度（EC50），其顯著超過治療劑量可達到的峰值血清濃度（CMAX）水平。

第三種方法是針對CoV的基因組資訊和病理學特征，開發特異性的藥物。包括靶向參與病毒復制周期的關鍵酶的siRNA分子或抑制劑、靶向宿主受體的單克隆抗體、宿主細胞蛋白酶抑制劑、宿主細胞的病毒內吞抑制劑、人類或人源化單克隆抗體。靶向S1亞單位RBD和靶向S2亞單位的抗病毒肽（圖2）。盡管這些藥物在體外和/或體內都有很強的抗CoV活性，但它們的藥代動力學和藥效學特性以及副作用尚待在動物和人體試驗中評估。此外，將這些候選藥物開發成臨床有用的治療方案，通常需要數年時間。

總的來說，這三種藥物發現方法通常在CoV暴發期間一起使用，以確定候選藥物化合物，這些化合物可大致分為基於病毒和基於宿主的治療方案。接下來將詳細講述基於病毒和基於宿主的治療方案。

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基於病毒的抗CoV治療策略

丨針對病毒核苷、核苷酸和核酸

核苷和核苷酸是病毒核酸的組成部分。以核苷或核苷酸和/或病毒核酸為靶點的藥物通常具有廣譜抗多種冠狀病毒和其他病毒的活性（表2）。黴酚酸酯（Mycophenolate mofetil）是一種抑制肌苷單磷酸脫氫酶和鳥嘌呤單磷酸酯合成的抗排斥藥物。活性化合物麥考酚酸（mycophenolic
acid）在體外對各種病毒具有抗病毒活性。高通量篩選發現麥考酚酸在體外具有較強的抗MERS-CoV活性。然而，隨後在非人類靈長類動物模型中的研究表明，與未經治療的動物相比，用黴酚酸酯治療的MERS共染的普通絨猴的病情更嚴重，壞死的肺和肺外組織中的病毒載量更高。接受黴酚酸酯維持治療的腎移植受者也出現嚴重或致命的MERS。因此，黴酚酸酯單藥治療的常規劑量不太可能用於預防或治療冠狀病毒感染。

核酶（RNA酶）是催化特定生化反應的RNA分子。一種存在於SARS-CoV mRNA的loop區的嵌合DNA-RNA錘頭狀核酶，特異識別堿基序列GUC，在體外顯著降低了重組SARS-CoV
RNA的表達。然而，核酶在體內迅速降解，因此必須優化人體內的傳遞方法。此外，還研究了針對特定宿主細胞膜結合CoV復制復合物的藥物。其中一種化合物K22，抑制膜結合CoV-RNA的合成，在體外，有的廣泛CoV具有活性。在細胞培養中，K22在病毒復制周期的早期階段發揮作用，損害DMVs的形成。抗K22的HCoV-229E逃逸突變體在NAP6的潛在跨膜結構域中有替換，NSP6是參與DMV形成的CoV復制復合物的跨膜組成部分，包括NSP
6H121L和NSP 6M159V。在隨後的體內研究中，應監測K22耐藥性的出現。

近年來，一類以長病毒雙鏈RNA（dsRNA）為靶點的廣譜抗病毒藥物被報導。例如，dsRNA激活的caspase寡聚物（DRACO）是一種具有病毒dsRNA結合域和促凋亡域的嵌合蛋白，其選擇性地誘導含有病毒dsRNA的宿主細胞凋亡，但保留未受感染的宿主細胞。DRACO在體外、體內，對許多RNA病毒都有活性。如果能夠實現有效的DRACO給藥方式，一種針對高度保守的CoV-RNA序列的廣譜抗CoV藥物可能成為現實。

丨針對病毒內的關鍵酶

所有參與CoVs復制的主要酶和蛋白質都是潛在的藥物靶點（表2）。SARS-CoV和MERS-CoV的PLpro酶具有蛋白水解、二氫喹啉化和去糖基化的作用。結晶學促進了這些PLpro酶的表征和抑制劑的鑒定。目前，鑒定出了不同種類的SARS-CoV-PLpro抑制劑，包括小分子抑制劑、硫嘌呤化合物、天然產物、鋅離子和鋅共價抑制劑以及萘抑制劑。然而，其中一些藥物隻抑制PLpro的酶活性而不抑制病毒復制，反之亦然。在動物或人類研究中均未驗證。此外，由於不同CoVs的PLpro酶的結構差異，大多數PLpro抑制劑具有窄譜活性。由於SARS-CoV和MELS-CoV的PLpro酶的結構不同，阻斷loop2（BL2）結構域，大多數SARS-CoV-PLPro抑制劑對MELS-CoV不起作用。

3CLpro是另一種主要的CoV蛋白酶，在病毒復制過程中切割pp1a和pp1ab蛋白。SARS-CoV
3CLpro可被多種蛋白酶抑制劑靶向，包括鋅或汞結合物、C2對稱二醇、擬肽-α、β-不飽和酯、苯胺、苯並三唑、N-苯基-2-乙酰胺、聯苯砜、谷氨酸和帶有三氟甲基酮基的谷氨酰胺肽，嘧啶酮和吡唑類似物。其中一些3CLpro抑制劑，在體外，對具有高度相似的底物識別關鍵殘基的CoVs具有廣譜活性。在這些3CLpro抑制劑中，洛匹那韋lopinavir，一種用於治療愛滋病毒感染的蛋白酶抑制劑，通常以利托那韋增強型（洛匹那韋-利托那韋）的形式銷售。洛匹那韋、洛匹那韋-利托那韋在體外、感染MERS-CoV的非人靈長類動物和SARS患者的非隨機試驗中均具有抗CoV活性。不過耐藥性，還有待觀察。

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RdRp是CoV復制-轉錄復合物的重要組成部分，參與基因組和亞基因組RNA的產生。利巴韋林是一種具有廣譜抗病毒活性的鳥苷類似物，已用於治療嚴重呼吸道合胞病毒感染、丙型肝炎病毒感染和病毒性出血熱。其確切的作用機制尚不清楚，但抑制mRNA封頂和誘導RNA依賴性病毒復制突變。大劑量利巴韋林已被用於治療SARS患者，但其療效尚不明確。在體外和感染MERS-CoV的恒河猴中，高劑量的MERS-CoV具有中等的抗MERS-CoV活性，但在小群體的MERS患者中沒有明顯的生存優勢。而且，大劑量利巴韋林會造成嚴重副作用，限制了其在嚴重CoV感染患者中的臨床應用。

最近，一種新的腺苷類似物BCX4430（免疫球蛋白-A）被開發出來。它是一種非專一的RNA鏈終止劑，可抑制多種RNA病毒的RNA聚合酶，包括SARS-CoV和MERS-CoV等冠狀病毒以及伊波拉和馬爾堡病毒等絲狀病毒。它在人類用途的發展已經被快速跟蹤，以增加最近在西非流行的伊波拉病毒的治療選擇的數量。現有的核苷類似物，如阿昔洛韋，可以通過加入柔性體來修飾，增加結合的親和力，並且可以克服結合位點的突變引起的抗性。這些非環柔性核苷類似物，在體外微摩爾濃度下，抑制MERS-CoV和HCOV-NL63。值得注意的是，由於RdRp突變，引起核苷類似物的耐藥性已被報導用於其他RNA病毒，當這些藥物用於治療CoV感染時，應予以監測。除了核苷類似物外，靶向SARS-CoV-RdRp的siRNA分子也被用於體外抑制SARS-CoV。

在CoV復制周期中，在ATP依賴性反應中，解旋酶催化雙鏈寡核苷酸解聚成單鏈。由於不同CoV的解旋酶具有高度同源性，因此解旋酶抑制劑是抗CoV治療的重要選擇。根據其作用機制，CoV螺旋酶抑制劑可大致分為兩類。第一組包括巴拿寧和5-羥基色酮衍生物，它們抑制SARS-CoV螺旋酶的解旋和ATP酶活性，從而抑制病毒的體外復制。然而，由這些化合物抑制細胞ATP酶或激酶所產生的毒性限制了它們的開發。第二類CoV螺旋酶抑制劑包括選擇性抑制CoV螺旋酶解旋活性而非ATP酶活性的化合物。SSY
A10-001就是一個例子，它是一種三唑類化合物，能抑制多種CoV，包括SARS-CoV、MERS-CoV和小鼠肝炎病毒。SSY A10-1001的毒性還需在動物模型中驗證。

丨針對病毒的刺突糖蛋白

包膜上的刺突糖蛋白S是一種主要的免疫原性抗原，對病毒和宿主細胞受體之間的相互作用至關重要（圖2）。含有抗MERS-CoV-S抗體的血清，阻斷了病毒附著，加速了MERS-CoV感染的BALB/c小鼠的肺內病毒清除，這些小鼠最近被導入腺病毒載體表達人類DPP4（表2）。在症狀發作後3周，小群體SARS患者接受含有中和抗體（可能是針對CoVs）的康復期血漿，出院率顯著升高，死亡率也較低。然而，CoV暴發時使用恢復期血漿治療會因康復患者的良好意願受到限制。有報導稱，在細胞和動物研究中，使用低抗體滴度的產品治療，導致與免疫增強相幹的疾病惡化。

為了克服這些問題，研究者通過免疫人免疫球蛋白轉基因小鼠，克隆未成年和恢復期患者的小鏈可變區，以及恢復期S特異性B細胞的永生化，制備了針對SARS-CoV
S不同區域的單克隆抗體。這些單抗大多以S1亞單位RBD上的特異表位為靶點，抑制病毒-細胞受體結合，而其他單抗則與S2亞單位結合，阻斷病毒-細胞融合。無論其結合位點和機制如何，這些單克隆抗體在體外和小動物模型中都表現出中和活性和降低病毒滴度。類似地，針對MERS-CoV
S的S1亞基RBD上不同表位的單克隆抗體也被開發出來。這些單克隆抗體與RBD結合的親和力比人DPP4高10倍至450倍以上，因而在體外具有更廣泛和更高的中和活性。重要的是，兩種或兩種以上協同作用的人源化或人源性單克隆抗體靶向非交叉耐藥表位或S的不同區域的聯合治療可能有助於減少病毒突變以逃避抗體介導的中和作用的頻率。用這些單克隆抗體治療MERS感染的人DPP4轉基因小鼠和表達人DPP4的腺病毒載體轉染的小鼠具有保護作用。應進一步評估其安全性和對患者的治療效果。

靶向S不同區域的抗病毒肽是另一種有前途的治療策略。SARS-CoV和MERS-CoV的S2亞基或莖區均為Ⅰ類病毒融合蛋白，均含有N端融合肽、七肽重復序列1（HR1）和HR2結構域、跨膜結構域和細胞質結構域。抗病毒肽類似於SARS-CoV的N末端、跨膜前區或區分HR1和HR2結構域的柔性loop區，在微摩爾濃度下，可抑制40-80%的病毒斑塊形成。同樣，橫跨MERS-CoV的HR2結構域的抗病毒肽，在體外抑制S介導的細胞-細胞融合和病毒進入細胞。從HR2結構域衍生的一種肽，稱為HP2P-M2，如果在病毒攻擊之前或之後經鼻給藥，則保護C57BL/6小鼠和缺乏V（D）J重組激活蛋白1（RAG1）的小鼠，其10倍至1000倍以上肺內病毒滴度降低；這種保護作用是通過將這種肽與干擾素β結合而增強的。

結合針對S2亞單位不同區域的抗病毒肽，可能在體外具有協同作用，並克服耐藥的理論風險。重要的是，一種類似的融合抑制劑enfuvirtide，它與HIV的糖蛋白結合以阻止膜融合和HIV細胞進入，已經成功地用於治療HIV-1感染。成功的藥物開發包括對抗耐藥性的措施，因此有利於抗病毒肽需在體內的進一步評價；盡管siRNAs在體外和SARS-CoV感染的恒河猴體內具有抗病毒活性，但由於缺乏可靠的給藥方法，它們仍處於臨床前的發展階段。

另一類靶向S的抗CoV試劑是碳水化合物結合劑。格瑞弗森（Griffithsin）是從紅藻中分離得到的一種抗病毒蛋白。它與病毒表面糖蛋白（如S和HIV糖蛋白）上的低聚糖特異性結合。它在體外和感染SARS-CoV的老鼠中抑制了廣泛的CoV，包括SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43和HCoV-NL63。不過，應進一步評估這些藥物在人體內的最佳給藥方式和安全性。

丨針對病毒包膜、膜、核衣殼和輔助蛋白

E、
M和N以及一些輔助蛋白不僅對病毒的組裝是必需的，而且可能還具有抑制宿主免疫反應以促進病毒復制的額外功能。例如，輔助蛋白4a和4b，也可能是MERS-CoV的M和5，表現出干擾素拮抗活性，SARS-CoV-N作為RNA沉默的病毒抑制因子，抑制由短髮夾狀RNA或siRNAs引起的RNA干擾（表2）。靶向SARS冠狀病毒E、M、N、ORF3a、ORF7a或ORF7b的siRNAs抑制病毒在體外的復制。然而，與抗CoV
S siRNAs類似，這些siRNAs在更好的遞送方法出現之前，都不適合人類使用。

另外，越來越多的靶向這些蛋白質的特定結合位點或功能的試劑正在通過結晶學和功能分析產生。例如，病毒蛋白Viroporin抑制劑六亞甲基阿米洛利可降低SARS-CoV和HCoV-229E中E的離子通道活性；PJ34可與HCoV-OC43中N的N末端區域的一個獨特的核糖核苷酸結合囊結合。然而，由於這些蛋白的結合位點和功能是單個冠狀病毒所獨有的，因此這些試劑可能是窄譜的。

新型親脂性噻唑烷衍生物，如LJ001和JL103，是一類結合膜的光敏劑，能產生單線態氧分子，誘導脂膜性質的改變，防止病毒膜與靶細胞膜融合。它們對許多包膜病毒表現出廣譜的活性，並可能對冠狀病毒有活性。

基於宿主的抗CoV治療策略

丨增強宿主的固有免疫響應

宿主固有的干擾素應答是控制病毒感染後復制的關鍵。盡管CoVs能夠抑制干擾素對免疫逃避的反應，但它們在體外仍易受干擾素治療的影響。使用重組干擾素或干擾素誘導劑可增強干擾素應答（表3）。重組α-干擾素和β-干擾素可抑制體外及動物模型中SARS-CoV和MERS-CoV的復制。α干擾素或β干擾素與利巴韋林和（或）洛匹那韋-利托那韋等其他抗病毒藥物的各種組合，已被用於治療SARS或MERS患者。總的來說，由干擾素和利巴韋林組成的聯合治療並不能持續改善預後。體內外結果之間的明顯差異，可能與這些藥物的高EC50/Cmax比率以及症狀出現和給藥之間的延遲有關。這種延遲對MERS患者尤其重要，因為他們在症狀出現和死亡之間的中間時間間隔比SARS患者短得多。在受試的重組干擾素制劑中，使用抗MERS-CoV的EC50/Cmax比率最低的重組干擾素β-1b，應在感染早期的臨床試驗中與其他有效的抗病毒藥物聯合評估。

聚肌苷：聚胞苷酸(poly(I:C))
是一種dsRNA的合成類似物，能強烈誘導I型干擾素。在poly（I:c）給藥前不久被表達人DPP4的腺病毒載體轉染的BALB/c小鼠中，它顯著降低了MERS-CoV的載量，盡管其在標準細胞培養保護實驗中的作用尚未發表。在II期臨床試驗中，肌內注射聚賴氨酸和羧甲基纖維素穩定的poly(I:C)，惡性膠質瘤患者的耐受性良好。硝唑沙尼是另一種有效的I型干擾素誘導劑，已用於人體寄生蟲感染。它是一種合成的硝基噻唑-水楊酰胺衍生物，對包括犬冠狀病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、愛滋病病毒、輪狀病毒、諾如病毒和黃病毒在內的RNA和DNA病毒具有廣譜抗病毒活性。它已經在治療HCV感染和流感的II期和III期臨床試驗中進行了評估，具有良好的安全性。在動物模型中，具有抗SARS-CoV作用的其他天然免疫調節劑包括抗菌肽rhesus
θ-defensin 1和蛋白籠奈米粒protein cage nanoparticles，它們在誘導的支氣管相幹淋巴組織中引起宿主免疫應答。干擾素誘導劑和天然免疫調節劑與有效抗病毒藥物的聯合應用可能具有協同作用，不過應在動物模型中進行評估。

丨抑制與病毒復制有關的宿主信號門路

除了干擾素應答的直接增強外，其他細胞信號通路也被確定為潛在的抗CoV治療靶點（表3）。親環素類與SARS冠狀病毒NSP1相互作用,調節鈣調神經磷酸酶門路，在T細胞介導的適應性免疫應答中起重要作用。在體外，鈣調神經磷酸酶抑制劑環孢素抑制多種冠狀病毒。但由於其免疫抑制作用和標準治療劑量下高EC50/Cmax比值，限制了其臨床應用。新的非免疫抑制鈣調神經磷酸酶抑制劑對HCoV-NL63有抗病毒活性，對SARS-CoV和MERS-CoV的活性需要進一步評估。類似地，調節其他細胞信號門路的藥物，如激酶信號門路抑制劑，也表現出抗CoV活性，並且在商業上可用。然而，它們的毒性可能限制了它們在嚴重的冠狀病毒感染患者中的使用。

丨抑制病毒復制依賴的宿主因子

冠狀病毒利用特定的宿主因子進入和復制病毒（圖2）。宿主受體可被特異性單克隆或多克隆抗體、肽或功能抑制劑靶向（表3）。例如，抗DPP4單抗在體外抑制MERS-CoV細胞進入。YS110是一種重組人源化IgG1抗DPP4單抗，在晚期實體瘤患者中似乎具有良好的耐受性。在SARS-CoV治療中，小分子進入抑制劑如N-（2-氨基乙基）-1-氮丙啶乙胺（NAAE）在體外抑制ACE2和SARS-CoV介導的細胞-細胞融合的催化活性。ACE2關鍵片段類似的合成肽在體外也具有抗SARS-CoV的活性。然而，這些受體導向的化合物還沒有在CoV感染患者身上測試過。它們的抗CoV活性可能是窄譜的，因為不同的CoV利用不同的宿主細胞受體。此外，必須評估免疫病理學的風險，特別是考慮到這些受體的多種基本生物學和免疫學功能。

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CoVs通過內質體和（或）細胞表面門路進入宿主細胞，由切割和激活S的宿主蛋白酶促進。組織蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，參與內質體門路，可被組織蛋白酶抑制劑如K11777及其相幹的乙烯基砜類似物抑制。這些化合物對動物模型中的各種寄生蟲感染似乎是安全有效的，並且具有廣譜的抗包膜RNA病毒的活性，例如CoVs（SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E和HCoV-NL63）、絲狀病毒（伊波拉和馬爾堡病毒）和副黏病毒。TMPRSS2是一種介導細胞表面進入門路的絲氨酸蛋白酶；卡莫司他（camostat
mesylate）是一種合成的低分子量絲氨酸蛋白酶抑制劑，用於治療慢性胰腺炎，副作用小。體外實驗中，卡莫司他抑制SARS-CoV和MERS-CoV，提高SARS-CoV感染小鼠的存活率。另一種廣泛表達的宿主蛋白酶Furin在MERS-CoV S介導的進入中也起重要作用，體外實驗中，癸酰-Arg-Val
Lys-Arg-氯甲基酮阻斷furin，抑制MERS-CoV進入及細胞融合。

另一組候選抗CoV藥物，靶向CoV在細胞進入過程中的內吞作用。氯丙嗪是一種用於治療精神分裂症的抗精神病藥物，在體外對丙型肝炎病毒、α病毒和許多冠狀病毒，包括SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒都有活性。結合鈉/鉀轉運atp酶亞單位α1的強心劑類固醇，比如烏巴因和布法林，可在納摩爾濃度下，抑制網格蛋白介導的MERS-CoV內吞作用。然而，這些網格蛋白介導的內吞抑制劑的使用受到非常高的EC50/CMAX比值或毒性的限制。另外，高pH值也可以抑制細胞內吞作用。氯喹是一種抗瘧疾藥物，它能將質子隔離到溶酶體中，以增加細胞內的pH值，在體外對多種冠狀病毒（SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43）及其他RNA病毒具有廣譜抗病毒活性。然而，它並沒有顯著減少SARS-CoV感染小鼠的病毒復制，可能是因為細胞表面門路沒有同時被阻斷。不同的蛋白酶和內吞抑制劑的組合的抗-CoV效應、藥代動力學和藥效學譜和毒性應在體內進一步評價。

丨MERS-CoV疫苗的研制

控制由新病毒引起的流行病，快速診斷和有效疫苗往往是抗病毒治療的補充。盡管十多年來沒有新的人類SARS病例，但由於人畜共患傳染源在疫區的持續存在，中東地區仍繼續出現零星病例和MERS群，並向其他區域蔓延。有效的MERS-CoV疫苗對於阻斷從動物宿主和感染者到易感宿主的傳播鏈至關重要。

嚴重急性呼吸綜合征（SARS）和中東呼吸綜合征（MERS）的流行表明，快速準確的實驗室診斷對冠狀病毒（CoV）感染的臨床管理和流行病學控制至關重要。實時逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）可以定量病毒載量，有助於研究病毒的脫落模式，優化治療和感染控制策略。SARS病毒載量的高峰出現在症狀出現後的第10天，有助於預測臨床惡化的時間和加強支持治療的必要性。護理點核酸擴增試驗，如RT-loop介導的等溫擴增和RT-等溫重組酶聚合酶擴增，適用於現場評估，特別是在資源有限的地區。同樣，檢測大量表達的CoV抗原（如核衣殼蛋白）的分析可用於快速、高通量的實驗室診斷，而無需生物安全3級控制。大多數人和動物冠狀病毒的全基因組序列的快速可用性，使設計新的RT-PCR分析、來源鑒定和對新出現的冠狀病毒的分子監測所需的時間降至最低。這在MERS流行中得到了很好的證明，在從人類分離的MERS-CoV株的全基因組序列可用後，快速發展了針對獨特基因區域的高度敏感和特異的RT-PCR分析。比較基因組學研究很快發現攜帶與人類分離的MERS-CoV株高度相似的CoV的蝙蝠和駱駝，這兩種動物被確定為可能的CoV來源。對中東不同地區患者和動物的MERS-CoV基因組進行延續監測和分析，對於發現可能增加病毒在人與人之間有效傳播能力的突變非常重要。小RNA測序的數據分析和鎖定核酸探針的使用，使得新的檢測方法得以發展，以CoV基因組中短而豐富表達的基因區域為靶點，如先導序列。隨著CoV全基因組和診斷基因靶點數量的不斷增加，使得能夠同時檢測多個CoV或特定CoV的多個基因靶點。世界各地臨床實驗室越來越多地使用這些多重分析法，將加強我們對CoV感染的流行病學變化的了解，並使高危患者和接觸組的分層以進行早期治療和預防。

除了提高急性臨床診斷水平外，診斷進展還促進了CoV流行控制和抗CoV藥物開發的其他方面。在細胞培養中從臨床標本中分離出感染性病毒顆粒，在急性診斷CoV感染中的作用有限，因為大多數人的致病性CoV要麼難以培養，要麼很危險。盡管如此，最近的進展已經加強了它們在CoV發病機制研究中的應用，這對於確定新的治療靶點非常重要。以前不可培養的HCoV-HKU1，現在可以從在氣液界面上培養的人氣管支氣管上皮細胞和人肺泡II型細胞中分離出來。離體器官培養能夠識別與SARS和MERS嚴重肺外和肺外表現有關的重要病毒和宿主因子。來自不同器官的可用人和動物細胞系的數量正在增加，這些細胞系提供了對組織和物種趨向性的洞察。同樣，在成對的急性和恢復期血清樣本中檢測特異性抗CoV抗體主要用於血清流行病學研究和接觸追蹤，但不用於急性診斷。新的檢測方法，如刺突糖蛋白（S）假顆粒中和法，不需要生物安全3級控制，可在大規模血清流行病學研究和暴發調查中實現高通量抗體檢測。

先前在SARS動物模型中評估過的減毒活疫苗可能與免疫功能低下患者的播散性感染有關。滅活疫苗可能與動物攻擊時的免疫病理學有關。這些方法對於MERS疫苗的開發是不利的，因為相當一部分嚴重的MERS患者有共病或全身免疫損害的情況。使用DNA質粒、病毒載體、奈米粒子、病毒樣顆粒和重組蛋白亞單位的MERS的其他疫苗接種策略正在開發中，一些已在動物模型中進行了評估（表4）。在中東和大非洲之角等流行地區，為駱駝和駱駝接觸高風險的非免疫個體提供安全有效的MERS-CoV疫苗，將是控制目前流行的MERS一項重要措施。

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展望與挑戰

丨抗CoV藥物試驗動物模型

合適的動物模型對於檢測抗CoV藥物尤其重要，因為這些藥物中的大多數尚未用於人類。與為HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1引起的輕度感染所建立的有限數量的動物模型相比，各種小動物和非人類靈長類動物模型被用來研究SARS和MERS的發病和治療。確定ACE2和DPP4分別作為SARS-CoV和MERS-CoV的功能性受體，對建立具有代表性的嚴重人類疾病動物模型至關重要。一些不同的非人靈長類動物被發現對SARS-CoV有耐受性，但沒有一個能持續復制嚴重人類疾病的特征，也沒有觀察到死亡率，這些模型主要有助於滿足科赫的假設。小動物，包括年輕和年老的BALB/c和C57BL/6小鼠、T、B和/或NK細胞缺乏的敲除小鼠、金黃的敘利亞倉鼠和雪貂，可以有效地感染SARS-CoV，但很少有動物出現臨床上明顯的疾病。最有效的SARS小動物模型利用表達人ACE2和（小鼠）適應的SARS-CoV菌株的轉基因小鼠，這些菌株能夠在小鼠中引起致命疾病。這些ACE2轉基因小鼠和鼠首病毒株的有限可用性仍然是檢測抗SARS-CoV藥物的主要障礙。

與SARS相似，非人類靈長類動物模型也被用來滿足Koch的假設並研究MERS的發病機制。恒河猴隻發展出一種輕微的自我限制性疾病，對MERS治療的評價並不理想。相比之下，MERS-CoV感染的普通狨猴發展為一種播散性和致死性感染，與嚴重的人類疾病非常相似。然而，普通的絨猴數量有限，對這些小型靈長類動物的實驗技術要求很高。因此，對其他小動物MERS模型進行了評價。與SARS-CoV不同，大多數小動物，包括BALB/c小鼠、金黃敘利亞倉鼠、雪貂和兔子，對MERS-CoV感染不敏感。

經鼻接種表達人DPP4的腺病毒載體後再接種MERS-CoV是一種快速使小鼠易受MERS-CoV感染的新方法，但該病相對較輕，僅限於呼吸道。表達人DPP4基因的轉基因小鼠會發生嚴重的肺部和播散性感染，是目前治療MERS的最佳小動物模型。在體外抗病毒試驗中發現的抗MERS-CoV的潛在治療方案應在這些轉基因小鼠中進一步評估。

丨新型抗CoV藥物臨床開發中的一般挑戰

在新型抗CoV藥物的臨床開發中，有許多病毒學和患者相幹因素構成了重大挑戰。首先，CoV是最多樣化和最快速變異的病毒群之一，新的CoV在不可預測的時間反覆出現。因此，特別現有的大多數藥物可能對另一種新的CoV無效。尤其適用於病毒酶抑制劑、靶向S的單克隆抗體和抗病毒肽，以及靶向宿主細胞受體的藥物。其次，目前可用於HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1感染的動物模型數量有限。即使對於SARS和MERS，使用合適的動物模型（如攜帶ACE2或DPP4轉基因的小鼠和非人靈長類動物）進行的實驗，也只能在少數指定的研究生物安全3級實驗室中進行，而且這些實驗在技術上要求很高。最後也是最重要的一點是，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1引起的感染的臨床輕微程度，以及沒有新的SARS病例，這使得招募患者進入臨床試驗變得困難，降低了制藥公司開發針對這些CoV感染的特定抗病毒藥物的動機。在MERS-CoV首次被發現3年後，它對全球健康安全的持續威脅，為解決目前開發新型抗CoV藥物的障礙提供了一個黃金機遇。

謹慎的做法是，建立一個由臨床醫生、病毒學家和藥物開發人員組成的組織良好、多學科的國際合作網路，並作出政治上的承諾，以便使用已證明在體外和（或）動物模型中安全有效的抗CoV藥物進行臨床試驗。

丨臨床發展中治療方案的優先順序

盡管有大量的基於病毒和基於宿主的治療方案的報導，這些方案在體外對SARS和MERS有很強的治療作用，但在可預見的將來，只有少數方案可能在臨床環境中發揮其潛力。大多數藥物都有一個或多個主要的限制，首先，許多藥物在臨床相幹劑量下具有較高的EC50/Cmax比值。這類藥物的例子包括環孢素、氯丙嗪和干擾素α。其次，有些有嚴重的副作用或引起免疫抑制。例如，大劑量利巴韋林的使用可能與溶血性貧血、中性粒細胞減少、致畸性和心呼吸窘迫有關。用黴酚酸酯治療的梅斯科夫感染的普通絨猴比未治療的對照組在肺部和肺外組織中的病毒載量更高，從而發展成致命的感染。靶向宿主信號通路或受體的藥物可能引起免疫病理學改變。此外，缺乏可靠的體內給藥方法，對於siRNAs和其他以前沒有在人類中使用過的藥物來說尤其有問題。

展望未來，在進行中的MERS流行的臨床試驗中，應進一步評估的最可行的選擇包括單藥療法或包括洛匹那韋-利托那韋的聯合療法，干擾素β-1b和（或）單克隆抗體和靶向MERS-CoV
S的抗病毒肽。這些藥物在非人類靈長類動物或小鼠模型中對MERS具有保護作用。此外，它們要麼是上市藥物（洛匹那韋-利托那韋和干擾素β-1b），或已成功用於其他感染（如用於呼吸道合胞病毒感染的帕利珠單抗和用於愛滋病毒感染的恩福韋肽）。從長遠來看，新型廣譜泛冠狀病毒抗病毒藥物的開發可有效對抗多種冠狀病毒，可能成為循環和新出現的CoV感染的最終治療策略。

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參考文獻：

Zumla A, Chan J F W, Azhar E I, et al. Coronaviruses—drug discovery and therapeutic options[J]. Nature reviews Drug discovery, 2016, 15(5): 327.

–本文轉載自微信公眾號唯信計算

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