【飲食】母體攝入三氯蔗糖會改變子代腸道菌群，並加劇成年期肝脂肪變性

導讀

非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見的慢性肝病之一，被認為與飲食和腸道菌群失調有關。三氯蔗糖是一種有機氯人工甜味劑，它被越來越多地添加到日常食用的食品中，如軟飲料、谷類食品和無糖甜點。然而，越來越多的證據表明，過量的三氯蔗糖可引起腸道菌群失調，對宿主健康產生不利影響。而母體的飲食決定了新生兒的微生物群落，這種影響在子代的生活中還會繼續。本研究旨在探討母體攝入三氯蔗糖（maternal sucralose，MS）對子代成年期肝脂肪變性易感性的影響。

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文獻ID

英文題目：Maternal sucralose intake alters gut microbiota of offspring and exacerbateshepatic steatosis in adulthood

中文題目：母體攝入三氯蔗糖會改變子代腸道菌群，並加劇成年期肝脂肪變性

發表期刊：《Gut Microbes》IF：7.823

發表時間：2020/3/31

通訊作者：王邦茂、曹海龍

通訊單位：天津醫科大學總醫院

材料與方法

將C57BL/6孕鼠隨機分為MS組（懷孕期和哺乳期攝入MS）和母系對照組（MC組）。斷奶後，所有的幼仔在8周齡之前都以標準飲食餵養，然後用高脂飲食（HFD）餵養4周。對3周齡的幼鼠進行腸道發育、黏膜屏障功能和腸道菌群的檢測。此外，在第12周評估肝脂肪變性的嚴重程度、血清生化、脂質代謝和腸道微生物組成等。

圖1a 實驗流程圖

研究成果

1、MS抑制3周齡幼鼠的腸道發育，破壞腸道屏障

在本研究中，幼鼠的性別比例和總產仔數在MS組和MC組之間沒有顯著差異，且兩組均未發現死亡。除MS組子代在2~4周齡時體重明顯高於MC組外，其餘8周齡測定時間點兩組子代體重基本一致。但在HFD 15天後，MS組子代體重明顯高於MC組。因此，補充MS可輕微增加斷奶期子代體重，顯著加重HFD幼鼠的體重（圖1b）。

在小鼠出生後第三周之前，胃腸道的發育主要受母體營養的影響。本文研究了三氯蔗糖對3周齡幼鼠腸道發育和腸道屏障完整性的影響。MS組3周齡幼鼠的絨毛長度和隱窩深度明顯小於MC組（圖1c-d）。與MC組比較，MS組Ki67陽性增殖細胞數減少（圖2a）。同時，高碘酸希夫（PAS）陽性細胞（杯狀細胞）數量也減少（圖2b）。MUC2是杯狀細胞最重要的產物之一，與黏液層的形成密切相幹。根據MUC2陽性細胞的數量和mRNA的表達，與MC組相比，MUC2的表達量下調（圖2c-d）。緊密連接蛋白包括ZO-1、Claudin-1、Claudin-3和Occludin被認為是決定腸道屏障完整性的最重要因素。PCR數據顯示，MS組Claudin-1、Claudin-3、ZO-1表達明顯降低，Occludin表達與MS組相似（圖3a）。此外，免疫熒光也提示MS組中ZO-1蛋白表達下降（圖3b）。免疫球蛋白A（IgA）在腸道免疫屏障功能中起著關鍵作用，可以抑制病原體的黏附。IgA免疫熒光顯示，MS可顯著降低IgA在小腸的表達水平（圖3c-d），提示MS可抑制幼鼠早期腸道發育，破壞腸道屏障的完整性。

通過H&E染色發現，兩組幼鼠小腸和結腸沒有明顯的炎症反應（圖1c）。進一步評估促炎細胞因子的水平，包括IL-1β，IFN-γ和結腸組織TNF-α。發現MS 組中這些促炎細胞因子mRNA 表達水平明顯高於MC組（圖2e）。結果表明，攝入MS可引起子代腸道輕度炎症，損傷腸道屏障功能。

圖1b-d 母鼠攝入三氯蔗糖抑制了3周齡幼鼠的腸道發育

圖2 母鼠攝入三氯蔗糖擾亂幼鼠腸道增殖和分化，並誘發3周齡幼鼠結腸輕度炎症

圖3 母鼠攝入三氯蔗糖破壞幼鼠結腸的緊密連接，並使3周齡幼鼠小腸IgA減少

2、MS改變了3周齡幼鼠腸道微生物組成

通過16s rRNA測序對3周齡子代腸道菌群組成和結構進行分析。Venn圖顯示，MC組共356個OTU，MS組共281個OTU，兩組共同擁有268個OTU（圖4a）。分析兩組的微生物群落結構發現，門水平優勢物種分別是厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。MS組疣微菌門和變形菌門的相對豐度隨著擬桿菌門的減少而升高。在屬水平，MS組與MC組之間存在顯著差異的屬主要有：Akkermansia、Alistipes、Barnesiella、Blautia、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、Paraprevotella、Robinsoniella、Saccharibacteria_genera_inc-ertaesedis、鏈球菌屬（Streptococcus）。與MC相比，MS組 Akkermansia、Blautia、棒狀桿菌屬和Robinsoniella顯著增加；同時，Alistipes、Barnesiella、Paraprevotella、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis和鏈球菌屬減少（圖4b）。

通過Shannon和Simpson多樣性指數評估3周齡幼鼠的微生物alpha多樣性。MS顯著降低了alpha多樣性（圖4c）。通過主坐標（PCoA）分析和Adonis查驗對非加權 UniFrac 距離進行計算，計算兩組樣本間的差異。結果表明，MS對3周齡幼鼠的微生物組成有顯著影響（圖4d）。

圖4 母體攝入三氯蔗糖改變了3周齡幼鼠腸道微生物組成

通過LEFSe差異分析兩組細菌在門、綱、目、科、屬水平上的豐度差異（圖5a）。差異物種豐度熱圖如圖5b所示。其中MS組抗炎相幹的Alistipes相對豐度較低。Parabacteroides（一種能調節宿主代謝、減輕肥胖和代謝功能障礙的菌屬），在MS組中顯著降低。而與肥胖和代謝雜亂高度相幹的Blautia在MS組中顯著升高。此外，在MS組中，疣微菌門的Akkermansia（一種降解黏液的菌）相對豐度增加，這可能是由於3周齡子代黏膜屏障功能的破壞和炎症反應的增加。與MS組腸道輕度炎症增加相一致，埃希氏桿菌屬（Escherichia）/志賀氏桿菌（Shigella）和Anaerostipes在炎症性腸病和代謝雜亂中更為豐富的菌，在MS組中增加。鏈球菌和瘤胃球菌在MS組中減少，以往的研究中發現，這兩種菌與炎症呈負相幹。此外， MS 組產丁酸鹽細菌Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）和Clostridium XlVa顯著減少。這些結果表明，在孕期和哺乳期攝入MS可擾亂子代的腸道微生物組成。

圖5 母鼠攝入三氯蔗糖改變了3周齡幼鼠體內關鍵細菌和SCFAs的產生

3、MS降低了3周齡幼鼠盲腸內短鏈脂肪酸(SCFAs)含量

碳水化合物細菌發酵可產生醋酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽等腸道SCFAs。已有研究報導腸道屏障功能與腸道SCFAs濃度呈正相幹。在本研究中，MS組的丁酸鹽產量明顯低於MC組，乙酸和丙酸鹽產量也有下降的趨勢（圖5c）。上述發現以及上述微生物組成的變化提示，產生SCFAs的細菌數量的減少和丁酸鹽產量的下降可能與MS攝入導致腸道發育的抑制和腸道屏障的破壞有關。

4、MS加重了HFD誘導的成年小鼠肝脂肪變性

越來越多的研究表明，早期腸道微生物失衡和慢性炎症可能與成年期的不良後果有關。本文研究了早期攝入MS是否會增加成年期肝脂肪變性的風險。總的來說，MS組肝臟顏色為淡黃色，而MC組肝臟顏色為暗紅色（圖6a）。MS組肝臟及腹部脂肪組織重量較MC組明顯增加（圖6b）。與MC組相比，MS 組丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶顯著增加 。此外，MS組血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平明顯升高（圖6c）。

H&E染色證實，兩組12周齡幼鼠均有明顯的脂肪肝。MS組脂肪變性較嚴重，炎性細胞大量浸潤，出現部分片狀壞死。同時，MS組NAFLD活性評分(NAS)也顯著高於MC組（圖6d）。MS組肝臟的炎性細胞因子IL- 6和TNF-α等也升高（圖6e）。

與MC組相比，MS組Fasn、Acaca等脂肪酸合成基因表達水平升高，膽汁酸合成限制酶Cyp7a1基因被抑制，肝臟中調節膽汁酸合成的關鍵基因shp顯著上調（圖6f）。這些基因表達的改變提示了MS干擾脂肪酸和膽汁酸的生物合成和代謝。

圖6 母體攝入三氯蔗糖會加重12周齡幼鼠HFD誘導的肝脂肪變性

5、HFD加重了成年小鼠的菌群失調

本文重點研究了HFD 4周後，MS組和MC組腸道菌群變化。MS組共336個OTU, MC組共285個OTU，兩組共同擁有269個OTU（圖7a）。與HFD前相比，兩組中厚壁菌門和變形桿菌門的相對豐度均升高，而擬桿菌門的相對豐度均降低。然而HFD 9周後，MS組變形菌門的豐度比MC組下降得更明顯（圖7b）。

兩組間Shannon和Simpson多樣性指數（alpha多樣性）無顯著差異（圖7c）。在beta多樣性方面，Adonis分析顯示兩組之間存在顯著差異（圖7d）。基於未加權UniFrac距離的3周齡和12周齡子代的PCoA分析顯示，HFD確實部分稀釋了MS驅動的腸道菌群的差異（圖7e）。總之，本文研究結果表明，HFD嚴重加劇了後代腸道菌群的失調。然而，即使在HFD 4周後，MS組的腸道菌群與MC組仍有部分差異。

圖7 母體攝入三氯蔗糖加重12周齡幼鼠腸道發育不良

6、MS使3周齡幼鼠的GPR43表達量降低

有報導稱，丁酸鹽可激活G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor, GPCRs)，包括在腸上皮細胞和脂肪細胞上表達的GPR41、GPR43和GPR109A。這些GPCRs的激活似乎可以通過多種機制緩解NAFLD的進展。通過免疫組織化學方法檢測3周齡子代結腸中GPR41、GPR43和GPR109A的表達發現，在MS組和MC組中，GPR41、GPR43和GPR109A均在結腸組織中表達。然而，MS組結腸中GPR43的表達明顯低於MC組，並伴有產丁酸鹽細菌和丁酸鹽的減少（圖8a）。Real-time-PCR數據也顯示，3周齡子代結腸組織中GPR43的相對表達量較MC組下降（圖8b）。

7、丁酸梭菌通過體外激活GPR43降低炎性細胞因子的產生

與對照組相比，丁酸鹽和丁酸梭菌上清液刺激HCT116細胞後，GPR43 mRNA水平分別上調2.2倍和2.8倍，GPR109A mRNA水平分別上調2.9倍和2.1倍，但GPR41 mRNA表達無明顯變化。同時，丁酸梭菌上清液和丁酸鹽分別使TNF-α的表達下降26.3%和36.1%。此外，通過RNA干擾技術研究了丁酸梭菌的抗炎功能是否依賴於GPR43。沉默GPR43抑制了丁酸梭菌介導的TNF-α 表達量下調。在HCT8細胞中也出現了類似的結果（圖8c-g）。這些結果表明，丁酸梭菌通過激活GPR43具有抗炎作用。

圖8 丁酸梭菌通過激活GPR43降低炎性細胞因子的產生

研究結論

1

MS抑制3周齡幼鼠的腸道發育，破壞腸道屏障，導致腸道輕度炎症。

2

MS對3周齡幼鼠腸道的微生物組成有顯著影響，且HFD可顯著加重成年小鼠的菌群失調。

3

MS干擾成年小鼠的脂肪代謝，加重了HFD誘導的肝脂肪變性。

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