細胞外囊泡：未來診斷肝臟疾病的新標誌物｜前沿聚焦

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是一種由不同類型的細胞釋放到細胞外基質的膜性小囊泡，其功能是參與細胞間的分子運輸。EV內含有不同類型的分子，包括蛋白質、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，這些內容物質會隨著親代細胞分泌EV時的狀態和所處環境的改變而發生改變。即EV攜帶的內容物質信息代表了EV分泌之初親代細胞的細胞狀態。

註：miRNA（MicroRNA）是一種小分子非編碼RNA，可以通過促進mRNA的降解或阻斷mRNA的翻譯來抑制基因表達。目前已有大量研究表明miRNA與肝臟炎症有關。

細胞外囊泡幾乎存在於所有主要體液中，包括血液和尿液，也可以從細胞培養上清液中收集。

EV的特徵

EV的大小從30 nm到1000 nm不等，可根據其生物發生、大小和生物物理性質進一步分類。對EV的經典描述依據的是囊泡大小，當直徑＜150 nm時EV可被定義為外泌體，更大的囊泡（微泡，包括核外粒體、微粒和癌小體）直徑可達1,000 nm；當直徑>1000 nm時即為凋亡小體（表1）。上述定義尚未達成共識。

表1 細胞外囊泡的特徵

EV可作為肝臟疾病診斷中的重要標誌物

細胞外囊泡也來源於肝臟中不同類型的細胞，其內容物的組成因細胞應激而異。這也表明EV可能在各種肝臟疾病中具有不同的作用，並可以作為肝臟疾病的生物標誌物。

1. 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）

一些體外研究發現，肝細胞經溶血磷脂酰膽鹼或棕櫚酸酯處理後，其產生的EV包含有腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL）、CXCL10等參與巨噬細胞的激活和趨化的因子，而後者是脂肪性肝炎發生的必要步驟（圖1）。

圖1肝細胞損傷後，EV在Caspase-3蛋白的控制下釋放

Castano等人證明了高脂肪飲食小鼠產生的循環EV中含有miRNA（miRNA27a‐3p、miR27b‐3p、miRNA‐192和miRNA‐122），這些miRNA被轉染給健康小鼠後可以干擾後者與肝脂肪生成和炎症相關的基因。此外，Garcia‐Martinez等人發現，在NASH患者中，循環EV中的線粒體和線粒體DNA水平升高，且主要來源於肝細胞。

2. 酒精性脂肪肝

在酒精性肝炎嚙齒類動物模型中（酒精餵養小鼠），肝細胞和單核細胞來源的EV可能通過轉移miRNA和CD40L，在體內外參與巨噬細胞誘導的炎症反應。

關於診斷工具的發展，已經證實在酒精處理的HepG2細胞（肝細胞系）的上清液和酒精性脂肪性肝炎患者的血漿中，含有CD40L的EV計數顯著增加。在最近的酒精餵養嚙齒類動物的研究中，包含miRNA（諸如let7家族、miRNA-29a、miRNA-340等）的EV均有所增加。

Bissonnette等人評估了在EV中嵌入肝細胞來源的細胞角蛋白18（CK 18）片段M30和M65診斷酒精性肝炎的潛力。結果表明，M65‐EV和M30‐EV診斷酒精性肝炎的靈敏度分別為85%和65%，特異度分別為55%和75%。當評估總片段時，其診斷準確度達到了81%。

3. 肝纖維化與肝硬化

目前已證明，與健康人群相比，肝硬化患者的總EV計數更高，其血漿中幾個EV亞型的表面標誌物如CD4、CD8、CD11a、CD31、CD235和CK‐18的數量更多。Payance等人報導，CK-18陽性EV水平與肝硬化的嚴重程度相關，並可預測患者6個月死亡率。

此外，Welsh等人分析了NAFLD患者的EV譜及其與肝纖維化的關係，發現白細胞來源的CD14-和CD16-陽性EV計數與纖維化的嚴重程度相關。

目前的研究表明，通過檢測EV miRNA‐101、miRNA‐122、miRNA‐195、miRNA‐224、let‐7水平監測肝硬化從早期到晚期的進展，或通過檢測EV miRNA‐192水平診斷非常早期的肝纖維化，都是有可能的。

4. 病毒性肝炎

EV參與了乙型肝炎、丙型肝炎和戊型肝炎的傳播，病毒粒子通過肝細胞的外泌體分泌途徑擴散到鄰近細胞。最近Deng等人的體外研究發現，一種參與外泌體分泌途徑的蛋白Syntenin的過表達可誘導含有HCV E2蛋白的EV的釋放。Kakizaki等人的體外研究證明，HBV感染的Hep AD38細胞產生的EV能夠誘導可誘導單核細胞PD-L1表達上調，最終誘導T細胞免疫抑制。

其他研究表明，EV可在肝臟受病毒感染期間調節宿主防禦（圖2）。

圖2 在慢性丙肝病毒感染過程中，受感染的肝細胞通過將病毒RNA「藏到」EV內來做到免疫逃逸

慢性病毒性肝炎常導致纖維化，所以，肝纖維化的EV生物標誌物可用於監測病毒性肝炎感染。此外，最近的一項研究表明，由於病毒性肝炎的治療降低了慢性丙型肝炎患者的血小板來源EV水平，研究者懷疑病毒活性似乎與血漿中血小板來源EV水平呈正相關。

最重要的是，Sukriti等人證明，在接受抗病毒治療且血漿中檢測不到HBV DNA的患者中，其循環EV內含有HBV DNA，存在HBV再激活風險。

小結

細胞外囊泡含有多種功能性生物大分子，包括蛋白質、核酸和脂類等，在肝臟不同細胞間的傳遞信息過程中具有重要作用。細胞外囊泡可以通過激活受體細胞中不同的信號通路來改變其功能，從而對各種肝臟疾病的發生和進展機制產生影響。體液中的細胞外囊泡正在發展為一種潛在的肝病生物學標誌物與治療監測的新手段。但是，與現有生物標誌物和臨床指標相比，這一新型標誌物是否會改善肝病檢測手段或更好地指導治療，仍有待觀察。

醫脈通編譯自：Alexandre B, Jeremy M, Rémy S, et al. Extracellular vesicles: Future diagnostic and therapeutic tools for liver disease and regeneration [J]. Liver International (2019).

https://doi.org/10.1111/liv.14189